miR-328表達(dá)對(duì)心肌梗死小鼠心臟損傷的影響及其分子機(jī)制

張樂(lè)，高艷，李連香，曹懌瑋，馮景，鄧麥麗

1 陜西省人民醫(yī)院功能檢查科，西安710068；2 陜西省人民醫(yī)院婦科

微小RNA（miRNAs）是一類含有18～26 個(gè)核苷酸的具有調(diào)控性作用的內(nèi)源性非編碼性RNA，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與目標(biāo)mRNA 結(jié)合使其降解或沉默，介導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控［1］。自1993 年被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，miRNAs 因廣泛參與細(xì)胞生長(zhǎng)、組織分化等生物學(xué)過(guò)程而倍受關(guān)注［2］。現(xiàn)已證實(shí)，miRNAs 在冠心病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要作用。miR-328是miRNAs家族的一員，其在急性心肌梗死（AMI）患者血漿中的表達(dá)明顯升高，可作為AMI 診斷的重要生物學(xué)標(biāo)志物［3］。但國(guó)內(nèi)外關(guān)于miR-328 對(duì)心肌梗死（MI）患者心功能的影響及其作用機(jī)制報(bào)道較少。此前GUO 等［4］研究顯示，miR-328 過(guò)表達(dá)可抑制肺動(dòng)脈高壓患者L 型鈣離子通道β 亞基（CaV2）表達(dá)，但MI發(fā)生后這一通道是否也被抑制尚未可知。2018 年10 月—2021 年 1 月，本研究觀察了 miR-328 表達(dá)對(duì)MI 小鼠心臟損傷的影響，并探討其機(jī)制是否與CaV2有關(guān)。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康雄性C57B/L 小鼠125只，8～10周齡，體質(zhì)量20～25 g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。主要試劑：CaV2 抗體購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司，載有miR-328 的腺病毒溶液及載有抑制miR-328（anti miR-328）的腺病毒溶液均購(gòu)自上海漢恒生物科技有限公司，miRNAs cDNA 一鏈合成專用試劑盒及miRNAs 通用SYBR Green Ⅰ嵌合熒光試劑盒均購(gòu)自諾唯贊生物科技有限公司；75%乙醇、甲醇、HRP 標(biāo)記的二抗均購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司。主要儀器：電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 動(dòng)物建模與分組處理 選擇C57B/L 小鼠125只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、空病毒組、miR-328 組、anti miR-328 組，每組 25 只。除對(duì)照組外均建立MI 模型：使用3%異氟烷吸入麻醉后行氣管插管，氧氣通氣，左外側(cè)開(kāi)胸后，用8-0 尼龍縫線結(jié)扎左前降支（LAD），心電圖顯示ST 段明顯抬高提示建模成功。對(duì)照組開(kāi)胸后不做任何處理。空病毒組、miR-328 組及anti miR-328 組分別用微量注射器吸取腺病毒載體溶液、載有miR-328 的腺病毒溶液及載有anti miR-328 的腺病毒溶液各50 mL，于梗死周圍區(qū)域選取5個(gè)點(diǎn)進(jìn)行注射；注射完畢，縫合關(guān)胸，小鼠恢復(fù)自主呼吸后拔除呼吸機(jī)。

1.3 梗死心肌組織miR-328 表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 法。各組于處理后 24 h、1 周、2 周分別取5 只小鼠處死，迅速摘取心臟，剪取梗死區(qū)域。使用TRIzol 試劑提取總RNA，莖環(huán)法檢測(cè)miR-328表達(dá)，miR-328 上游引物 5′-GGACCGGGAGAGACGGG-3′，下游引物5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTGCCTT-3′；內(nèi)參U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游引物5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。采用2－ΔΔCt法計(jì)算miR-328相對(duì)表達(dá)量。

1.4 梗死情況觀察 采用TTC 染色。各組于處理后24 h 分別取4 只小鼠處死，迅速摘取心臟，PBS 溶液沖洗干凈，置于-20 ℃冰箱中速凍15 min，取出后迅速連續(xù)切成2 mm 厚度的切片。將切片置于1%TTC 染色溶液中，37 ℃避光水浴 15 min，每 5 min 輕輕晃動(dòng)以全面染色。正常區(qū)域染色為磚紅色，MI區(qū)域?yàn)榛野咨Ｊ褂萌R卡顯微鏡拍照，用Image Pro Plus 6.0 分析梗死面積，計(jì)算心肌梗死率。心肌梗死率=梗死面積/左心室切面總面積×100%。

1.5 心功能檢查 采用經(jīng)胸超聲檢查。各組于處理后1 周，使用3%異氟烷麻醉剩余小鼠，使用二維引導(dǎo)M 型超聲心動(dòng)圖機(jī)對(duì)小鼠心臟形態(tài)和功能進(jìn)行評(píng)估，測(cè)量左心室舒張期和收縮期的壁厚和直徑。取連續(xù)10個(gè)以上心動(dòng)周期的平均值，計(jì)算左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）。

1.6 梗死心肌組織CaV2 mRNA 及蛋白表達(dá)檢測(cè)取1.3中各組處理后1周的梗死心肌組織，分別檢測(cè)CaV2 mRNA 及蛋白表達(dá)。①CaV2 mRNA 表達(dá)：參照1.3 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)心肌組織CaV2 mRNA 相 對(duì) 表 達(dá) 量 。 CaV2 上 游 引 物 5′-AAGTGTGGATCTGCAGCCAT-3′，下游引物 5′-AT-GTGTCCCCTCTCACCAGA-3′；內(nèi)參 GAPDH 上游引物 5′-GGTGTGACAGTGACTTGGGA-3′，下 游 引 物5′-AAGTCGCAGGAGACAACCTG-3′。②CaV2 蛋白表達(dá)：采用Western blotting 法。取梗死心肌組織，蛋白裂解液提取總蛋白并進(jìn)行定量。心臟勻漿蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上；加入CaV2、GAPDH 一抗，4 ℃孵育過(guò)夜；次日PBST 洗膜后，加入HRP 標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h。紅外成像系統(tǒng)對(duì)膜進(jìn)行掃描，使用Quantity One軟件測(cè)量條帶灰度值，計(jì)算CaV2蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用方差分析，組間比較采用成組t檢驗(yàn)。梗死心肌組織miR-328 與CaV2 mRNA 表達(dá)的關(guān)系采用Pearson 相關(guān)分析法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠梗死心肌組織miR-328 表達(dá)比較 處理后24 h、1周，對(duì)照組、anti miR-328組＜模型組、空病毒組＜miR-328組（P均＜0.05）；處理后2周，anti miR-328組＜對(duì)照組、模型組、空病毒組＜miR-328組（P均＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)梗死心肌組織miR-328表達(dá)比較（）

表1 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)梗死心肌組織miR-328表達(dá)比較（）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組和空病毒組比較，#P＜0.05。

組別對(duì)照組模型組空病毒組miR-328組anti miR-328組2周0.99±0.15 1.01±0.13 1.05±0.19 1.34±0.09*#0.67±0.07*#n 5 5 5 5 5 24 h 0.59±0.12 1.00±0.15*0.92±0.15*1.47±0.23*#0.68±0.04#1周0.51±0.15 1.06±0.40*1.15±0.20*4.26±0.54*#0.48±0.11#

2.2 各組小鼠心肌梗死率比較 對(duì)照組、模型組、空病毒組、miR-328組、anti miR-328組心肌梗死率分別為0、23.00%±2.34%、23.00%±2.75%、35.00%±5.23%、16.00% ± 3.76%，對(duì)照組、anti miR-328 組＜模型組、空病毒組＜miR-328組（P均＜0.05）。

2.3 各組小鼠LVEF 比較 對(duì)照組、模型組、空病毒 組 、miR-328 組 、anti miR-328 組 LVEF 分 別 為58.00% ± 2.53%、40.00% ± 3.88%、40.00% ±2.73%、35.00% ± 2.61%、49.00% ± 2.07%，miR-328 組＜模型組、空病毒組＜anti miR-328 組、對(duì)照組（P均＜0.05）。

2.4 各組小鼠梗死心肌組織CaV2 mRNA及蛋白表達(dá)比較 對(duì)照組、anti miR-328組＞模型組、空病毒組＞miR-328組（P均＜0.05）。見(jiàn)表2、OSID碼圖1。

表2 各組小鼠梗死心肌組織CaV2 mRNA及蛋白表達(dá)比較（）

表2 各組小鼠梗死心肌組織CaV2 mRNA及蛋白表達(dá)比較（）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組和空病毒組比較，#P＜0.05。

組別對(duì)照組模型組空病毒組miR-328組anti miR-328組CaV2 蛋白0.67±0.08 0.41±0.07*0.46±0.04*0.21±0.03*#0.62±0.06#n 5 5 5 5 5 CaV2 mRNA 1.95±0.40 1.00±0.06*1.05±0.12*0.49±0.06*#1.76±0.15#

2.5 梗死心肌組織miR-328 與CaV2 mRNA 的相關(guān)性分析結(jié)果 梗死心肌組織miR-328 與CaV2 mRNA 相對(duì)表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r＝-0.775，P＜0.05）。

3 討論

心血管病是引起人類死亡的一個(gè)主要原因，MI更是危害人類健康的常見(jiàn)疾病［5］。心肌缺血后大量心肌細(xì)胞死亡，主要與心肌能量代謝紊亂、細(xì)胞內(nèi)酸堿中毒、生物膜完整性被破壞等病理生理過(guò)程有關(guān)，但具體的分子信號(hào)通路目前尚未完全闡明。miRNAs是一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，在心肌肥厚、心律失常、冠心病等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［6-7］。miR-328 廣泛存在于全身各組織，其在肥厚心肌組織中呈高表達(dá)，并參與了心肌肥厚的發(fā)展［8］。ZHAO 等［9］研究顯示，心肌細(xì)胞來(lái)源的miR-328 通過(guò)旁分泌調(diào)節(jié)鄰近成纖維細(xì)胞，從而促進(jìn)心肌纖維化的發(fā)生。LU 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，miR-328 在心房顫動(dòng)患者中高表達(dá)，參與影響心房電重構(gòu)，從而誘導(dǎo)房顫的發(fā)生。以上研究表明，miR-328 在多種心血管疾病中表達(dá)升高，并參與了心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，MI小鼠梗死心肌組織中的miR-328 高表達(dá)，且上調(diào) miR-328 表達(dá)后 MI 小鼠的心肌梗死面積顯著增加，心功能進(jìn)一步惡化；而抑制miR-328表達(dá)后，MI小鼠心肌梗死面積減小，心功能明顯好轉(zhuǎn)；提示miR-328 可加重MI 小鼠的心肌損傷，并降低其心功能。

目前，miR-328 通過(guò)何種機(jī)制對(duì)MI 小鼠的心臟功能產(chǎn)生影響尚不清楚，可能為多因素聯(lián)合機(jī)制［11-12］。L型鈣離子通道是電壓依賴性的鈣通道，由α1、β、α2/δ 亞基組成，L 型鈣離子通道激活時(shí)，大量鈣離子快速內(nèi)流形成L 型鈣離子電流（ICaL），參與快速去極化，特別在心肌興奮—收縮偶聯(lián)及其他電生理活動(dòng)中具有重要作用［13-14］。近年來(lái)，L型鈣離子通道因其參與心肌細(xì)胞肥厚［15］、心律失常［16-17］等心臟疾病而受到廣泛關(guān)注。BOSCH 等［18］研究發(fā)現(xiàn)，在家兔快速心房起搏模型中CaV2 表達(dá)與ICaL同步減少，且均早于α1c亞基mRNA 表達(dá)改變。張朝等［19］認(rèn)為，CaV2 表達(dá)降低導(dǎo)致功能性L 型鈣離子通道減少。另有研究表明，房顫時(shí)CaV2 作為miR-328 的mRNA靶點(diǎn)而被抑制，導(dǎo)致心房肌細(xì)胞ICaL下降，心肌收縮能力減弱［10］。本研究結(jié)果顯示，MI小鼠梗死心肌組織miR-328 表達(dá)增加的同時(shí)，CaV2 mRNA 及蛋白相對(duì)表達(dá)量均下降；上調(diào)miR-328 表達(dá)則CaV2 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量進(jìn)一步下降，小鼠心功能進(jìn)一步惡化；抑制miR-328 表達(dá)則CaV2 mRNA 及蛋白相對(duì)表達(dá)量上升，小鼠心功能改善；此外，相關(guān)性分析結(jié)果提示心肌梗死組織miR-328 與CaV2 mRNA 表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。以上結(jié)果提示，miR-328 可能通過(guò)轉(zhuǎn)錄后抑制CaV2 mRNA 表達(dá)，從而減少CaV2蛋白合成，導(dǎo)致心功能降低；反之，CaV2蛋白合成增加、心功能改善。因此，我們推測(cè)miR-328 調(diào)控MI小鼠心功能的作用機(jī)制可能與轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)CaV2 表達(dá)，引起L型鈣離子通道數(shù)量變化，進(jìn)而影響心肌收縮功能有關(guān)。

綜上所述，MI 小鼠梗死心肌組織miR-328 表達(dá)升高，miR-328可加重MI小鼠心肌損傷、導(dǎo)致心功能降低，其機(jī)制可能與負(fù)性調(diào)控CaV2 表達(dá)有關(guān)；提示miR-328 可能是MI 治療的有效靶點(diǎn)，可為臨床保護(hù)缺血心肌提供了新思路。