miR-200c對人絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞遷移、侵襲、EMT的影響及其分子機制

郝媛媛，徐曼，安泓潤

河北中石油中心醫(yī)院產(chǎn)科，河北廊坊065000

絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞是胎盤最主要的組成細(xì)胞之一，也是維持胎盤正常功能的最重要的功能細(xì)胞，目前普遍認(rèn)為人絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移、侵襲功能障礙可能引發(fā)子癇前期（PE）的發(fā)生［1］。上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化成間質(zhì)細(xì)胞的過程，細(xì)胞轉(zhuǎn)化后極性和黏附功能丟失，但獲得了較高的侵襲及遷移能力。目前研究已經(jīng)證實，人絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移、侵襲功能障礙與其EMT 過程受損有關(guān)［2-3］。miR-200c 是近年來發(fā)現(xiàn)的與 EMT 調(diào)控有關(guān)的miRNAs 家族成員之一，其在PE 大鼠胎盤組織和PE 患者的血清中表達均明顯升高，但其異常升高是否影響絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞遷移、侵襲及EMT 尚不明確［4-5］。2021 年 1 月—4 月，本研究觀察了 miR-200c表達對人絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞遷移、侵襲及EMT 的影響，并探討其可能的機制。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞：人絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞HTR8/Svneo購自美國ATCC 公司，用含10%胎牛血清的RPMI 1640 細(xì)胞培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。主要試劑：TRIzol 試劑、LipofectamineTM2000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑均購自美國Invitrogen 公司，8.0 μm 孔徑 Transwell 小室購自美國 Corning 公司，Mgtrigel 基質(zhì)膠購自美國BD 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量檢測試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司，miR-200c和內(nèi)參U6引物均購自廣州銳博生物技術(shù)有限公司；miR-200c 模擬物（miR-200c mimics）、miR-200c 抑制物（miR-200c inhibitor）、miRNA 陰性對照（miR-NC）、Notch1 野生型（WT）和突變型（MUT）熒光素酶報告基因質(zhì)粒載體均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；一抗Notch1、N-cadherin、Fibronectin、E-cadherin、GAPDH 抗體均購自美國Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗IgG均購自武漢博士德公司。

1.2 細(xì)胞分組及處理 將對數(shù)生長期的HTR8/Svneo 細(xì)胞，以 1×105/mL 接種至 6 孔板中，培養(yǎng) 24 h，將細(xì)胞分為過表達組、沉默組和對照組，三組按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000 說明書步驟操作，分別轉(zhuǎn)染 miR-200c mimics、miR-200c inhibitor、miR-NC。

1.3 細(xì)胞miR-200c 表達檢測 采用實時熒光定量PCR 法。三組轉(zhuǎn)染24 h，采用TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。加入引物，以cDNA 為模板，應(yīng)用實時熒光定量試劑盒進行擴增反應(yīng)。PCR 引物序列：miR-200c 上游引物5′-GCCCGCTAATACTGCCGGGTAAT-3′、下游引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′，內(nèi)參U6 上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′、下游引物 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR 反應(yīng)過程：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，共40個循環(huán)。以U6作為內(nèi)參，采用2－ΔΔCt法計算miR-200c相對表達量。

1.4 細(xì)胞遷移能力觀察 采用細(xì)胞劃痕實驗。收集三組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h 的細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，以 1×105/mL 接種至 6 孔板，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞鋪滿整個細(xì)胞板孔面，使用無菌加樣槍頭（規(guī)格200 μL）垂直于細(xì)胞板作一直線劃痕，PBS 沖洗，加入無血清細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。各組分別在劃痕后0、24 h 于顯微鏡下觀察細(xì)胞劃痕間距，計算細(xì)胞遷移率，細(xì)胞遷移率（%）=（0 h 劃痕間距-24 h 劃痕間距）/0 h劃痕間距×100%。

1.5 細(xì)胞侵襲能力觀察 采用Transwell 侵襲實驗。收集三組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h 的細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，并將細(xì)胞密度調(diào)整為1×105/mL。取Transwell 小室，用預(yù)冷的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋Mgtrigel 基質(zhì)膠，將其對小室底膜上室面進行預(yù)鋪膠。取0.3 mL 細(xì)胞懸液接種至小室上室，將含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基加入小室下室，在37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出小室，擦掉小室膜上表面的殘留細(xì)胞，4%甲醛固定小室膜下表面的穿膜細(xì)胞。結(jié)晶紫溶液染色30 min，光學(xué)顯微鏡下計數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，以此表示細(xì)胞侵襲能力。

1.6 細(xì) 胞 E-cadherin、N-cadherin、Fibronectin 及Notch1 蛋白表達檢測 采用Western blotting 法。收集三組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h 的細(xì)胞，細(xì)胞總蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，取30 μg 蛋白樣品上樣，4%濃縮膠和12%分離膠行SDS-PAGE 電泳；將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，置入含50 g/L 脫脂奶粉的封閉液中封閉2 h。分別加入一抗E-cadherin（稀釋比1∶1 000）、N-cadherin（稀釋比 1∶2 000）、Fibronectin（稀釋比1∶2 000）、Notch1（稀釋比1∶1 000）和GAPDH（稀釋比1∶10 000），4 ℃孵育過夜；TBST 洗膜后加入二抗IgG（稀釋比1∶10 000），室溫孵育2 h。加入ECL 發(fā)光試劑在暗室發(fā)光顯影，成像系統(tǒng)拍照后分析各條帶灰度值。以GAPDH 作內(nèi)參，計算E-cadherin、N-cadherin、Fibronectin 及 Notch1 蛋白相對表達量。

1.7 miR-200c 與Notch1 的靶向關(guān)系驗證 采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灐TR8/Svneo 細(xì)胞以1×105/mL 接種于96 孔細(xì)胞板上，分為四部分，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000 分別共轉(zhuǎn)染Notch1-WT、Notch1-MUT 與 miR-200c mimics、miRNC。轉(zhuǎn)染24 h 后收集細(xì)胞，使用熒光素酶檢測試劑盒檢測細(xì)胞的熒光素酶活性，計算相對熒光素酶活性。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用SNK-q法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞miR-200c 相對表達量比較 過表達組、沉默組及對照組細(xì)胞miR-200c 相對表達量分別為2.36±0.21、0.53±0.14、1.06±0.08，組間兩兩比較P均＜0.05。

2.2 各組細(xì)胞遷移率比較 過表達組、沉默組及對照組細(xì)胞遷移率分別為16.2% ± 2.1%、81.2% ±4.6%、51.1%±3.8%，組間兩兩比較P均＜0.05。見OSID碼圖1。

2.3 各組細(xì)胞侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)比較 過表達組、沉默組及對照組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（45 ± 11）、（310 ±29）、（181 ± 20）個，組間兩兩比較P均＜0.05。見OSID碼圖2。

2.4 各組細(xì)胞EMT 相關(guān)蛋白及Notch1 蛋白表達比較 過表達組、對照組、沉默組E-cadherin 蛋白相對表達量依次降低，N-cadherin、Fibronectin 和 Notch1蛋白相對表達量依次升高，組間兩兩比較P均＜0.05。見表1、OSID碼圖3。

表1 各組細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白及Notch1蛋白相對表達量比較（）

表1 各組細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白及Notch1蛋白相對表達量比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與過表達組比較，#P＜0.05。

組別過表達組沉默組對照組Notch1 0.20±0.09*1.29 ±0.16*#0.76±0.14 E-cadherin 1.29±0.13*0.33 ±0.11*#0.69±0.15 N-cadherin 0.42±0.13*1.52 ±0.18*#1.02±0.11 Fibronectin 0.26±0.07*1.09 ±0.09*#0.73±0.12

2.5 miR-200c 與Notch1 的靶向關(guān)系驗證結(jié)果 轉(zhuǎn)染Notch1-WT 和miR-200c mimics 的細(xì)胞相對熒光素酶活性為0.31±0.09，轉(zhuǎn)染Notch1-WT和miR-NC的細(xì)胞為 0.99 ± 0.03（P＜0.05）；轉(zhuǎn)染 Notch1-MUT和miR-200c mimics 的細(xì)胞相對熒光素酶活性為1.00 ± 0.05，轉(zhuǎn)染 Notch1-MUT 和 miR-NC 的細(xì)胞為1.02 ± 0.04（P＞0.05）。

3 討論

miRNAs 是一類長度為20～22 個核苷酸的非編碼小分子RNA，能夠調(diào)控靶基因翻譯或轉(zhuǎn)錄，參與機體細(xì)胞的生理病理活動及許多疾病的發(fā)生發(fā)展。PE患者血清和胎盤組織均發(fā)現(xiàn)有多種miRNAs表達異常，這些異常表達的miRNAs可能造成絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞功能的異常［6］。REN 等［7］發(fā)現(xiàn)，過表達 miR-375能夠抑制PE 大鼠絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和增殖。YANG 等［8］發(fā)現(xiàn)，PE 患者血漿 miR-215-5p 表達明顯升高，并且與絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞遷移、侵襲功能降低有關(guān)。在PE 血漿和胎盤組織中，miR-141-3p 和miR-200a-3p表達均升高，并且可能與絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞的功能異常有關(guān)［9］。miR-200c 是 miR-200 家族成員之一，近期研究發(fā)現(xiàn)其在PE 大鼠胎盤組織和PE 患者血清中的表達均明顯升高，但其異常升高是否影響絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞遷移、侵襲尚不清楚［4-5］。本研究結(jié)果顯示，過表達miR-200c 的絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯下降，而沉默miR-200c 的絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯升高，提示miR-200c 能夠影響絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

EMT 是機體細(xì)胞的一個重要生理過程，通過這個過程，極化的上皮細(xì)胞具有了間充質(zhì)表型，其中包括遷移和侵襲能力，這對于細(xì)胞的發(fā)育和功能維持至關(guān)重要。目前研究認(rèn)為，滋養(yǎng)細(xì)胞EMT 受損與其遷移、侵襲功能受限有關(guān)，可能是PE 發(fā)病的重要機制，也為PE 的治療提供了新的研究方向［10-11］。已有研究證實，miR-200c 與EMT 密切相關(guān)，但其對人絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響是否與EMT調(diào)控有關(guān)尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，過表達miR-200c 的人絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞上皮源性標(biāo)志物E-cadherin 蛋白表達升高，間質(zhì)源性標(biāo)志物N-cadherin和Fibronectin蛋白表達降低；反之，沉默miR-200c的人絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞上皮源性標(biāo)志物E-cadherin 蛋白表達降低，間質(zhì)源性標(biāo)志物N-cadherin 和Fibronectin蛋白表達升高；提示miR-200c 過表達可導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞EMT障礙，從而降低了細(xì)胞的遷移、侵襲能力。

Notch 信號通路是調(diào)控EMT 的重要信號通路之一，也是著床和胎盤形成過程中發(fā)揮重要作用的信號通路之一［12］。Notch1 是 Notch 信號通路的主要受體之一，其在PE胎盤組織和人絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞中表達均降低，而Notch1 表達降低可能會影響滋養(yǎng)細(xì)胞的 EMT，從而影響其遷移、侵襲能力［13-15］。研究發(fā)現(xiàn)，在許多生理或病理過程中，miR-200c 均可通過靶向調(diào)控Notch1 而發(fā)揮作用［16-17］。本研究雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，miR-200c 與Notch1 存在靶向關(guān)系，并且過表達miR-200c 的滋養(yǎng)細(xì)胞Notch1蛋白表達下降，而沉默miR-200c 的滋養(yǎng)細(xì)胞Notch1蛋白表達升高，提示miR-200c 可負(fù)性調(diào)控Notch1表達。

綜上所述，miR-200c 能夠抑制人絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移、侵襲及EMT，從而參與了PE的發(fā)病，其機制可能與靶向調(diào)控Notch1有關(guān)，為PE的靶向治療提供了新的研究方向。