二甲雙胍對抑郁癥大鼠抑郁樣行為的影響及其分子機制

丁昊，房慧，李志剛

1 淄博市精神衛生中心精神科，山東淄博255100；2 淄博市精神衛生中心心理咨詢與治療中心；3 菏澤市中醫醫院腦病科

抑郁癥是以顯著而持久的情緒低落為主要特征的精神障礙性疾病，具有較高的致殘率、復發率及自殺率，其發病機制不明確，且尚無特效的治愈方法［1-2］。近來研究發現，抑郁癥患者的記憶及情感控制能力降低，可能與海馬損傷及體積縮小有關，且抑郁癥模型動物海馬神經元中存在大量自噬，并認為自噬介導的細胞凋亡增強可能是引起抑郁癥患者海馬損傷的主要原因［3］。磷脂酰肌醇（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）通路活化可調控細胞增殖、分化及凋亡，且PI3K/Akt活化可調控下游雷帕霉素靶蛋白mTOR活化，參與調控細胞自噬，被認為是促進細胞存活、抑制自噬的關鍵通路［4］。研究顯示，PI3K/Akt/mTOR 通路介導的細胞凋亡及自噬反應可能參與了抑郁癥海馬神經元凋亡過程［5］。二甲雙胍是一種降糖藥，近來發現其也具有抗衰老及神經保護作用［6］。已有研究顯示，二甲雙胍可改善抑郁癥大鼠抑郁樣行為［7］。但二甲雙胍改善抑郁大鼠抑郁樣行為的具體機制是否與PI3K/Akt/mTOR 通路介導的細胞凋亡及自噬有關尚未可知，為此我們于2019 年6 月—2020年12月進行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：清潔級雄性SD 大鼠60 只，6～8周齡，體質量200～220 g，購自北京百奧賽圖基因生物技術有限公司，生產許可證號SCXK（京）2020-0007。主要試劑：二甲雙胍購自中美上海施貴寶制藥有限公司；PI3K/Akt 抑制劑NVP-BEZ235 購自愛必信上海生物科技有限公司，雷帕霉素購自上海寶曼生物科技有限公司；TUNEL 染色試劑盒購自北京伊塔生物科技有限公司，LC3B（ab192890）、PI3K（ab154598）、磷酸化 PI3K（p-PI3K，ab182651）、Akt（ab8805）、磷 酸 化 Akt（p-Akt，ab38449）、mTOR（ab134903）、磷酸化mTOR（p-mTOR，ab45996）、自噬相關蛋白Beclin1（ab210498）、抗凋亡蛋白Bcl2（ab203516）、Atg13（ab201467）等兔抗大鼠抗體均購自美國Abcam公司。

1.2 抑郁癥大鼠模型建立及分組處理 取50 只SD 大鼠，均給予慢性不可預見性應激壓力刺激建立抑郁癥大鼠模型［7］，并隨機分為模型組、二甲雙胍組、PI3K/Akt 抑制劑組、二甲雙胍+抑制劑組、雷帕霉素組，每組10 只。另取10 只SD 大鼠作為正常對照組。二甲雙胍組參照文獻［7］設置二甲雙胍劑量100 mg/kg，并按10 mg/mL（生理鹽水溶解成混懸液）、10 mL/kg 的劑量進行腹腔注射，1 次/天，連續14 d；PI3K/Akt 抑制劑組參照文獻［8］經腹腔注射PI3K/Akt 抑 制 劑 NVP-BEZ235 22.5 mg/kg，3 天/次，共4 次；雷帕霉素組參照文獻［8］灌胃給予雷帕霉素2 mg/kg，1 次/天，連續14 d；二甲雙胍+抑制劑組參照上法同時腹腔注射二甲雙胍和NVP-BEZ235；模型組及正常對照組腹腔注射10 mL/kg 生理鹽水，連續14 d。

1.3 大鼠行為變化評估

1.3.1 一般行為 各組大鼠給藥結束后，記錄飲食、精神、活動等一般行為變化。

1.3.2 抑郁樣行為 各組大鼠給藥結束后，進行蔗糖水消耗實驗、曠場實驗、強迫游泳和懸尾不動實驗，分別記錄糖水偏愛率、曠場中央運動距離、強迫游泳不動時間、懸尾不動時間。各實驗均參照文獻［7］方法進行操作。

1.4 大鼠海馬組織神經元結構及自噬現象觀察 采用透射電鏡觀察。各組大鼠行為觀察結束后進行麻醉，尾靜脈空氣栓塞法處死，取完整海馬組織，剪取1 cm×1 cm 組織塊送電鏡室處理，觀察海馬神經元結構及自噬體、溶酶體形成情況，并進行拍照。將剩余海馬組織分成兩部分，一部分置于－80 ℃冰箱內保存備用；另一部分置于4%多聚甲醛中固定24 h，浸蠟、包埋后進行5 μm厚度切片。

1.5 大鼠海馬組織神經元凋亡情況觀察 采用TUNEL 染色法。取各組大鼠相同部位海馬組織石蠟切片，按TUNEL 染色液說明書方法染色后，于顯微鏡下觀察并隨機取5 個視野，凋亡神經元陽性染色為紅棕色，采用Image-Pro Plus 6.0 軟件記錄凋亡神經元數及總細胞數。神經元凋亡率（%）=凋亡神經元數/總細胞數×100%。

1.6 大鼠海馬組織LC3B、p-mTOR表達檢測 采用免疫組化法。取各組大鼠相同部位海馬組織石蠟切片，二甲苯脫蠟及梯度乙醇脫水后，4 ℃孵育盒中滴加LC3B、p-mTOR 一抗（1∶200）孵育過夜，滴加IgG二抗室溫孵育30 min。DAB顯色、封片后，光鏡下觀察拍照，每個切片隨機取5 個視野。采用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析每個視野下陽性染色（棕黃色）的平均光密度（OD）值，以此表示LC3B、p-mTOR 陽性表達水平。

1.7 大鼠海馬組織PI3K/Akt/mTOR 通路及下游相關蛋白表達檢測 采用Western blotting 法。取各組大鼠冰凍海馬組織，4 ℃解凍，粉碎及勻漿處理后，提取總蛋白。BCA 法檢測蛋白濃度，取100 μg 蛋白樣品行電泳、轉膜反應，4 ℃孵育盒中滴 加 PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、Atg13、Bcl2、Beclin1 一抗（1∶1 500）及內參 β-actin抗體（1∶2 000）孵育過夜，次日滴加HRP 山羊抗兔二抗（1∶2 000）繼續孵育2 min。增強化學發光法顯影曝光后，Image J 軟件分析并計算目的條帶相對灰度值。

1.8 統計學方法 采用SPSS22.0 統計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用方差分析，組間和組內比較分別采用成組t檢驗和配對t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般行為比較 正常對照組大鼠飲食及活動正常；模型組大鼠精神萎靡，活動減少、食欲減退、眼睛無神等明顯；二甲雙胍組大鼠食欲及活動增加，精神萎靡及眼睛無神較模型組減輕。PI3K/Akt 抑制劑組及雷帕霉素組大鼠上述癥狀較模型組進一步加重，二甲雙胍+抑制劑組大鼠上述癥狀與模型組相近。

2.2 各組大鼠抑郁樣行為相關指標比較 見表1。

表1 各組大鼠糖水偏愛率、曠場中央運動距離、強迫游泳不動時間、懸尾不動時間比較（）

表1 各組大鼠糖水偏愛率、曠場中央運動距離、強迫游泳不動時間、懸尾不動時間比較（）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組及二甲雙胍+抑制劑組比較，#P＜0.05；與二甲雙胍組比較，△P＜0.05。

組別正常對照組模型組二甲雙胍組PI3K/Akt抑制劑組雷帕霉素組二甲雙胍+抑制劑組懸尾不動時間（s）97.02±6.11 143.39±9.53*88.93±7.15#179.22±8.44*#△181.36±8.09*#△149.38±6.20*n 10 10 10 10 10 10糖水偏愛率（%）66.85±5.11 49.21±3.46*65.25±5.22#26.27±2.62*#△25.56±2.40*#△48.81±3.49*曠場中央運動距離（m）4.00±0.39 2.39±0.21*4.03±0.35#1.28±0.14*#△1.30±0.19*#△2.30±0.20*強迫游泳不動時間（s）4.00±0.44 26.39±2.11*5.53±0.55#40.22±4.24*#△41.36±4.09*#△24.38±2.20*

2.3 各組大鼠海馬神經元結構及自噬現象比較 正常對照組大鼠海馬神經元結構正常、完整，核質均勻，細胞器清晰。模型組大鼠海馬神經元細胞核膜局部斷裂且模糊不清，核內染色質邊緣聚集，細胞質中可見明顯的自噬體及自噬溶酶體。二甲雙胍組大鼠海馬神經元核膜局部斷裂減輕，細胞質空泡化、自噬體及自噬溶酶體形成均減少；PI3K/Akt 抑制劑組及雷帕霉素組大鼠海馬神經元結構損傷及自噬現象較模型組加重，二甲雙胍+抑制劑組大鼠海馬神經元結構損傷及自噬現象與模型組相近。見OSID碼圖1。

2.4 各組大鼠海馬組織神經元凋亡率比較 正常對照組、模型組、二甲雙胍組、PI3K/Akt 抑制劑組、雷帕霉素組、二甲雙胍+抑制劑組大鼠海馬組織神經元凋亡率分別為 3.16% ± 0.29%、26.08% ±2.84%、6.05% ± 0.59%、39.08% ± 3.11%、38.75%± 3.02%、25.89% ± 2.80%；與正常對照組比較，模型組大鼠海馬組織神經元凋亡率升高（P＜0.05）；與模型組比較，二甲雙胍組大鼠海馬組織神經元凋亡率降低（P＜0.05），PI3K/Akt抑制劑組及雷帕霉素組均升高（P均＜0.05），二甲雙胍+抑制劑組無明顯變化（P＞0.05）。見OSID碼圖2。

2.5 各組大鼠海馬組織LC3B、p-mTOR 表達比較見表2和見OSID碼圖3、4。

表2 各組大鼠海馬組織LC3B、p-mTOR表達比較（）

表2 各組大鼠海馬組織LC3B、p-mTOR表達比較（）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組及二甲雙胍+抑制劑組比較，#P＜0.05；與二甲雙胍組比較，△P＜0.05。

p-mTOR 1.04±0.02 0.37±0.03*0.89±0.05#0.18±0.02*#△0.15±0.02*#△0.40±0.03*組別正常對照組模型組二甲雙胍組PI3K/Akt抑制劑組雷帕霉素組二甲雙胍+抑制劑組n 10 10 10 10 10 10 LC3B 0.22±0.06 1.09±0.16*0.55±0.05#1.81±0.18*#△1.86±0.17*#△1.11±0.11*

2.6 各組大鼠海馬組織PI3K/Akt-mTOR 通路及下游相關蛋白表達比較 見表3和OSID碼圖5、6。

表3 各組大鼠海馬組織PI3K/Akt-mTOR通路及下游相關蛋白表達比較（）

表3 各組大鼠海馬組織PI3K/Akt-mTOR通路及下游相關蛋白表達比較（）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組及二甲雙胍+抑制劑組比較，#P＜0.05；與二甲雙胍組比較，△P＜0.05。

組別正常對照組模型組二甲雙胍組PI3K/Akt抑制劑組雷帕霉素組二甲雙胍+抑制劑組Bcl2 1.12±0.09 0.69±0.05*0.96±0.09#0.17±0.01*#△0.20±0.02*#△0.61±0.06*n 10 10 10 10 10 10 p-PI3K/PI3K 1.01±0.10 0.39±0.03*0.91±0.09#0.19±0.11*#△0.02±0.02*#△0.40±0.04*p-Akt/Akt 1.07±0.11 0.48±0.04*0.99±0.09#0.20±0.02*#△0.23±0.03*#△0.50±0.05*p-mTOR/mTOR 1.12±0.09 0.59±0.05*1.06±0.11#0.15±0.01*#△0.10±0.01*#△0.57±0.06*Beclin1 1.01±0.10 1.99±0.19*1.21±0.11#2.59±0.21*#△2.52±0.22*#△1.90±0.19*Atg13 1.07±0.11 1.88±0.18*1.29±0.11#2.30±0.22*#△2.33±0.23*#△1.80±0.18*

3 討論

情感淡漠、思維遲鈍、興趣喪失、悲觀絕望、動作遲緩、自殺自殘等是抑郁癥最主要的心理及軀體癥狀［10］。慢性不可預見性應激壓力刺激是誘導模擬人類抑郁樣行為的重要方法［11］。本研究建立大鼠模型后發現，抑郁癥大鼠精神萎靡、活動減少、食欲減退、眼睛無神等癥狀明顯，糖水偏好實驗、強迫游泳和懸尾不動實驗、曠場實驗發現大鼠出現快感缺失（糖水偏愛率降低）、絕望行為增加、自發活動減少、興趣及活動能力降低等類似人類抑郁癥的行為，提示大鼠造模成功。抑郁癥發病機制復雜，海馬神經元結構及功能損傷是導致抑郁癥患者情緒、學習記憶及行為調節失常的重要原因。LAROY等［12］研究發現，抑郁癥會造成海馬損傷及體積縮小，從而導致海馬負責的情感及功能受損；LIU等［13］發現，抑郁癥患者海馬神經元出現結構破壞及數量減少現象。本研究也在抑郁癥模型大鼠海馬組織中檢測到神經元細胞核內染色質增多、核膜增厚、核仁移位，核周間隙擴大及細胞器較少等結構損傷現象，且海馬神經元凋亡率明顯高于正常對照組大鼠，提示海馬神經元凋亡與大鼠抑郁癥關系密切。二甲雙胍除降糖外，還具有神經保護作用。FATEMI等［14］發現，另外，二甲雙胍可通過抑制神經元凋亡及應激性損傷，上調神經營養因子（BDNF）表達，來發揮抗癲癇及神經保護作用。二甲雙胍也對焦慮、抑郁、認知障礙等神經精神疾病有緩解作用。HUSSEIN等［15］發現，二甲雙胍可改善高脂飲食大鼠抑郁樣癥狀和認知障礙。本研究結果顯示，給予大鼠二甲雙胍干預治療后，大鼠抑郁樣行為減少，同時海馬神經元損傷及凋亡明顯減少，提示二甲雙胍可能成為治療抑郁癥的潛在藥物。

自噬可消化和清除受損的細胞器、蛋白質，給細胞生存提供相對穩定及適宜的內環境，但自噬也是一種程序性死亡方式，可作為死亡機制誘導細胞發生程序性死亡，而參與神經系統疾病的發生發展［16］。自噬被適度激活可保護細胞免于凋亡和壞死，但嚴重刺激時，自噬過度激活可引發細胞程序性死亡。自噬也與抑郁癥患者神經元凋亡關系密切。張勝等［17］研究發現，抑郁癥大鼠海馬神經元中存在自噬過度激活現象，并認為抑郁癥海馬神經元凋亡及海馬體積萎縮可能與細胞自噬過度激活有關。本研究發現，模型組大鼠海馬神經元損傷及凋亡的同時，海馬神經元細胞自噬溶酶體增多，且自噬標記蛋白LC3B 在神經元細胞質中的表達升高，提示抑郁癥大鼠海馬神經元存在明顯的細胞自噬。

mTOR 是自噬發生的抑制性激酶，其激活后可磷酸化Atg13，使其與Atg13 的結合能力下降，進而抑制自噬［18］。雷帕霉素為mTOR 的抑制劑，本研究用雷帕霉素抑制mTOR活化、促進自噬來干預治療抑郁癥后發現，大鼠海馬神經元中p-mTOR 降低，自噬及自噬標記蛋白LC3B、Beclin1表達進一步升高的同時，大鼠抑郁樣行為及神經元凋亡損傷均進一步加重，證實神經元過度自噬，可能是抑郁癥大鼠抑郁行為及神經元損傷凋亡加重的相關機制。PI3K/Akt為mTOR的上游調控因子，其不僅是細胞存活的關鍵通路，且活化后可正向調控mTOR 活性，介導自噬的產生。MA 等［19］發現，Akt 磷酸化水平升高可磷酸化Bcl2 家族凋亡促進因子，從而抑制凋亡途徑的起始過程，發揮促細胞生存作用。蔡蕭君等［20］發現，抑郁癥模型大鼠海馬神經元中存在PI3K/Akt/mTOR 活性水平降低，并認為PI3K/Akt/mTOR 活化水平降低，其介導的自噬及凋亡激活，可能是引起抑郁癥大鼠抑郁行為及海馬神經元損傷凋亡發生的關鍵機制。本研究在模型組大鼠海馬神經元中檢測到PI3K/Akt磷酸化水平及p-mTOR水平降低，以及自噬活性升高，而抑制PI3K/Akt通路活化后大鼠海馬神經元自噬、凋亡進一步升高，其抑郁樣行為進一步加重；證實PI3K/Akt通路活化水平被抑制，可加重抑郁癥大鼠抑郁樣行為。二甲雙胍組大鼠海馬組織中PI3K/Akt/mTOR 磷酸化水平處于激活狀態，提示二甲雙胍改善抑郁癥大鼠抑郁行為及海馬神經元損傷凋亡作用，可能與促進PI3K/Akt/mTOR 磷酸化激活、抑制海馬神經元自噬及凋亡有關。二甲雙胍與PI3K/Akt通路抑制劑聯合應用后，大鼠抑郁行為、海馬神經元自噬及凋亡反應均明顯高于單獨應用二甲雙胍組，證實阻斷PI3K/Akt通路可削弱二甲雙胍對抑郁癥的改善作用。

綜上所述，二甲雙胍可減輕抑郁癥大鼠抑郁樣行為，其機制可能與促進PI3K/Akt/mTOR 通路磷酸化激活、抑制海馬神經元自噬及凋亡有關。這為闡明二甲雙胍在抗抑郁癥方面的研究應用提供一定依據，但抑郁癥海馬神經元損傷及凋亡機制復雜，可能涉及代謝、應激等多方面機制，二甲雙胍治療抑郁癥的其他機制還需進一步探究。