潰瘍性結腸炎患者血清CDX2 mRNA、miR-22水平變化及其與病情活動程度的關系

董秀紅，殷祿昌，于玉環(huán)，魏蒙萌，劉勇蓮，張鴻

1 濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院消化內科，山東濰坊261000；2 山東第一醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院健康管理中心

潰瘍性結腸炎（UC）是一種慢性非特異性腸道炎癥性疾病，病變部位主要涉及直腸、結腸黏膜和黏膜下層，常表現(xiàn)為腹瀉、腹痛、膿血便，可伴隨其他全身癥狀，具體病因尚不明確［1］。UC 多為活動期與緩解期交替，易反復發(fā)作，嚴重影響患者身心健康。Mayo 評分雖能較好地評價UC 患者的病情嚴重程度，但在實際臨床應用中仍有部分患者的病情與Mayo 評分并不相符。因此，臨床亟需尋找能有效評估UC 患者病情的輔助指標。尾型同源盒轉錄因子2（CDX2）是一種腸道特異性核轉錄因子，與腸黏膜的發(fā)育和功能維持密切相關，其在結直腸癌組織中的表達明顯下調，并與結直腸癌患者預后不良有關［2-3］。微小RNA（miRNAs）是一種內源性非編碼的小 RNA 分子，通過與目標基因 mRNA 的 3′-非翻譯區(qū)特異性結合，在轉錄水平上抑制其表達，參與人類多種疾病的發(fā)生發(fā)展［4-5］。研究顯示，miR-22 可參與調節(jié)腸道屏障完整性和腸道通透性，通過介導炎癥反應參與 UC 的發(fā)生發(fā)展［6］。但是目前 CDX2、miR-22 與UC 患者病情程度的關系尚不明了，為了進一步探討CDX2、miR-22 與UC 患者病情活動程度的關系，我們進行了如下研究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取 2017 年 1 月—2019 年 1 月濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院收治的UC 患者102例（觀察組），均符合中華醫(yī)學會消化病學分會炎癥性腸病學組制定《中國炎癥性腸病組織病理診斷共識意見》［7］中的UC 診斷標準。排除標準：①合并惡性腫瘤；②合并心肝腎等重要臟器功能障礙；③合并聽力、意識、認知功能障礙等不能配合完成本研究者；④妊娠期、哺乳期女性；⑤合并腸梗阻、穿孔等結腸擴張；⑥合并感染性疾病或血液系統(tǒng)疾病。觀察組男59例、女43例，年齡（45.16±6.74）歲，BM（I21.87±2.49）kg/m2，病變范圍：直腸炎及乙狀結腸炎56 例、左半結腸炎27 例、全結腸炎19 例；根據(jù)Mayo 評分分為活動期（Mayo 評分＞2 分）60 例、緩解期 42 例（Mayo 評分為0～2 分），活動期患者中輕度活動17 例（Mayo 評分3～5分）、中度活動23例（Mayo評分6～10分）、重度活動20 例（Mayo 評分11～12 分）。選擇同期體檢健康志愿者60 例（對照組），男37 例、女23 例，年齡（45.07 ± 5.14）歲，BMI（21.35 ± 2.84）kg/m2。兩組性別、年齡、BMI 均具有可比性（P均＞0.05）。本研究通過醫(yī)院倫理委員會審核，患者均簽署知情同意書。

1.2 血清CDX2 mRNA、miR-22 檢測方法 采用實時熒光定量PCR 法。觀察組入院次日晨起抽取空腹靜脈血5 mL、對照組于體檢當天清晨抽取空腹靜脈血 5 mL；EDTA 抗凝，2 000 r/min 離心 15 min，分離上清液于干凈EP 管中，-70 ℃保存待測。采用TRIzol 試劑提取血清總RNA，檢測總RNA 濃度和純度，OD260/OD280為1.8～2.2 提示純度較好。利用逆轉錄試劑盒以RNA 為模板，將其反轉錄為cDNA，采用PCR 擴增試劑盒進行擴增。PCR 反應體系及反應條件均參照試劑盒說明書。CDX2 mRNA 以GAPDH 為內參，miR-22 以 U6 為內參基因，引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成。CDX2 mRNA 上 游 引 物 5′-CGCCGCAGAACTTCGTCAG-3′，下游引物5′-CGTAGCCATTCCAGTCCTCCC-3′；GAPDH 上 游 引 物 5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT，下游引物 5′-GGCTGTTGTCATACT-TCTCATGG-3′；miR-22 上游引物 5′-AAGCTGCCAGTTGAAGAACTGTA-3′，下 游 引 物 5′-AGTTGCTAAGATATGCGACAC-3′；U6 上 游 引 物 5′-CCCTCCAGAGAGCGTTATGTGA-3′，下游引物5′-GTTTCTGAAAATTACAGGGTCATTTGTG-3′。采用 2－ΔΔCt法計算CDX2 mRNA、miR-22水平。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗或LSD-t檢驗。活動期UC 患者血清CDX2 mRNA 與miR-22 水平的關系采用Pearson 相關分析法。采用多因素Logistic回歸分析UC 患者病情活動的影響因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組血清CDX2 mRNA、miR-22 水平比較 觀察組活動期、緩解期患者血清CDX2 mRNA 水平均低于對照組，血清miR-22 水平均高于對照組，活動期患者變化更明顯（P均＜0.05）。見表1。

表1 兩組血清CDX2 mRNA、miR-22水平比較（）

表1 兩組血清CDX2 mRNA、miR-22水平比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與觀察組緩解期患者比較，#P＜0.05。

5.26±0.82*#2.16±0.47*1.04±0.12組別觀察組活動期緩解期對照組n CDX2 mRNA miR-22 60 42 60 0.47±0.08*#0.82±0.24*1.07±0.13

2.2 不同臨床活動度的活動期UC 患者血清CDX2 mRNA、miR-22 水平比較 輕度、中度、重度活動的活動期UC 患者血清CDX2 mRNA 水平依次下降，血清miR-22水平依次升高（P均＜0.05）。見表2。

表2 不同臨床活動度的活動期UC患者血清CDX2 mRNA、miR-22水平比較（）

表2 不同臨床活動度的活動期UC患者血清CDX2 mRNA、miR-22水平比較（）

注：與輕度患者比較，*P＜0.05；與中度患者比較，#P＜0.05。

臨床活動度輕度中度重度n 17 23 20 CDX2 mRNA 0.63±0.17 0.49±0.13*0.31±0.08*#miR-22 3.19±0.45 5.12±0.87*7.42±1.24*#

2.3 活動期UC患者血清CDX2 mRNA與miR-22水平的關系 活動期UC 患者血清CDX2 mRNA 與miR-22水平呈負相關關系（r=-0.537，P＜0.01）。

2.4 血清 CDX2 mRNA、miR-22 水平與 UC 患者病情活動程度的關系 緩解期UC 患者男23 例、女19例，年齡（44.92 ± 6.41）歲，BMI（21.69 ± 2.17）kg/m2，吸煙14 例（28.57%），病變位置在直腸及乙狀結腸23 例（41.07%）、左半結腸12 例（44.44%）、全結腸 7 例（36.84%）；活動期UC 患者男36 例、女24 例，年齡（45.43 ± 6.80）歲，BMI（22.07 ± 2.51）kg/m2，吸煙35 例（71.43%），病變位置在直腸及乙狀結腸33 例（58.93%）、左半結腸15 例（55.56%）、全結腸12 例（63.16%）；活動期UC 患者吸煙比例高于緩解期UC 患者（P＜0.05），兩者其他指標比較均無統(tǒng)計學差異（P均＞0.05）。血清 CDX2 mRNA 水平降低（OR=1.463，95%CI：1.020～2.098）、miR-22 水平升高（OR=1.527，95%CI：1.088～2.143）是影響UC患者病情活動的獨立危險因素。見表3。

表3 影響UC患者病情活動的多因素Logistic回歸分析結果

3 討論

UC的病因及發(fā)病機制目前尚無明確定論，大約7%的UC 患者在疾病發(fā)作30 年后會進展為結腸癌［8］。因此，尋找有效評估UC 病情進展的血清學指標對早期改善患者預后具有重要意義。CDX2 在腸上皮細胞的增殖和分化中發(fā)揮重要作用。研究表明，CDX2 在腫瘤性腸上皮細胞中的表達具有相對較高的靈敏度和特異度，可用作腸源性腫瘤的免疫組織化學標志物［9］。CDX2 可參與調節(jié)上皮細胞的極性作用，其表達缺失被認為與上皮—間質轉化有關，在臨床病理學中可作為腸道分化的生物標志物［10］。腸黏膜蛋白是腸道質膜和上皮質肌動蛋白細胞骨架的重要連接物，可維持腸道屏障完整性，CDX2 表達降低與E-鈣黏蛋白缺失及緊密連接完整性喪失有關［11］。本研究結果顯示，活動期UC 患者血清CDX2 mRNA 水平低于緩解期UC 患者，且均明顯低于健康對照人群；且隨著活動期UC 患者病情活動程度的增加，患者血清CDX2 mRNA 水平呈明顯下降趨勢；表明血清CDX2 mRNA 水平可反映UC患者的病情活動程度，其水平異常降低與患者病情進展有關。

miR-22 是 17p13.3 染色體的 C17orf91 基因外顯子，其作為腫瘤標志物提示多種癌癥的發(fā)生，如肺癌、結直腸癌等［12-13］。PEI 等［14］研究發(fā)現(xiàn)，在炎癥性腸病患者腸黏膜組織的CD4+細胞中miR-22 表達顯著升高，過表達的miR-22 及Th17 細胞特異性轉錄因子（RORC）參與了炎癥細胞因子的表達升高，可能通過靶向HDAC4 促進Th17 細胞分化，從而參與炎癥性腸病進展。本研究結果顯示，活動期UC 患者血清miR-22 水平高于緩解期，且均明顯高于健康對照人群；且隨著活動期UC 患者臨床活動程度的增加，患者血清miR-22 水平呈明顯升高趨勢；表明血清CDX2 mRNA 水平可反映UC 患者的病情嚴重程度，其水平異常升高與患者病情進展有關。另有研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-22 可抑制結腸癌腫瘤細胞增殖、遷移及上皮—間質轉化作用，E-鈣黏蛋白表達升高，可發(fā)揮抑癌基因作用［15］。該研究結果與本研究結果趨勢相反，推測可能與腫瘤異質性有關，可能miR-22 在炎癥性腸病到癌變的過程中發(fā)揮了不同作用，其具體作用機制有待深入研究。

本研究多因素Logistic 回歸分析結果顯示，血清CDX2 mRNA 水平降低、miR-22 水平升高均是影響UC 患者病情活動的獨立危險因素，可能是提示UC患者病情重度活動的潛在指標。miRDB 數(shù)據(jù)庫預測網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)，CDX2 與miR-22 存在靶向關系。本研究相關性分析結果顯示，活動期UC 患者血清CDX2 mRNA、miR-22水平之間呈負相關關系，提示miR-22可能通過靶向調控CDX2 在UC 患者的病情進展中發(fā)揮作用，但仍需進一步研究驗證。

綜上所述，隨著臨床活動程度的增加，UC 患者血清CDX2 mRNA 水平逐漸降低，miR-22 水平逐漸升高，二者是導致UC 患者病情活動的危險因素，可為臨床判斷UC 患者病情活動程度提供有效的生物學指標。