補腎法對肺癌骨轉移微環境影響的機制研究*

付淑娟，張士強，吳婷婷，李蕓，鐘薏，蔣海燕，周張杰，曹晟成，潘平生，莊紅文

1 上海中醫藥大學附屬上海市中西醫結合醫院 上海 200082 2 上海中醫藥大學 上海 200032 3 上海市松江區方塔中醫醫院 上海 201699

據國家癌癥中心發布的最新全國癌癥統計數據顯示，肺癌在我國前五位惡性腫瘤中的發病率和死亡率中都占據第一位，仍是威脅人民健康的首個惡性疾病[1]。骨轉移在肺癌遠處臟器轉移中最常見，晚期肺癌患者中約30%～40%會出現骨轉移[2]。骨轉移臨床多表現為疼痛、病理性骨折等骨相關事件，嚴重威脅患者的生活質量及縮短患者生存期，而目前抗骨轉移治療僅能延緩骨轉移的進展，是臨床治療難點之一。

近年來，針對骨轉移骨微環境的變化及分子機制的研究有了更深入精準的認識。骨微環境中細胞豐富，最具代表的細胞有成骨細胞、破骨細胞、骨髓基質細胞、免疫細胞、血管內皮細胞等。骨微環境中的各種細胞相互作用，相互調控加速骨轉移的發生發展。肺癌骨轉移以溶骨性轉移為主，其中成骨細胞與破骨細胞是腫瘤骨轉移過程中引起溶骨性轉移的關鍵因素[3-4]。肺癌細胞分泌的促破骨細胞生成因子刺激成骨細胞前體分化為成熟的成骨細胞，成骨細胞分泌的細胞核因子κB配基受體激活劑（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）通 過RANKL信號通路激活破骨細胞，活化的破骨細胞一方面提高骨的重吸收介導轉移灶的骨質破壞，另一方面釋放骨基質存儲的生長因子等刺激肺癌細胞的再增殖[5]。由成骨細胞合成的骨保護素（osteoprotegerin，OPG）會和RANKL產生競爭性結合RANK，從而起到抑制破骨細胞分化、成熟的作用[6]，RANK/RANKL/OPG信號系統中RANKL與OPG分泌的量直接影響著破骨進程。

通過對骨微環境、肺癌骨轉移的機制進行分析研究，恢復骨微環境平衡，抑制腫瘤破骨進程，對骨轉移的治療具有指導意義。本文通過觀察益腎固骨方對小鼠肺癌骨轉移模型及OPG和RANKL表達的影響，探究該方對骨微環境的影響，揭示該方治療肺癌骨轉移的主要作用機制，為臨床的應用提供實驗依據。

材料與方法

1 材料

1.1 藥物 益腎固骨方組成為熟地、山萸肉、骨碎補等。顆粒劑購自華潤三九醫藥股份有限公司，用蒸餾水配制成含生藥濃度為1.17g/mL的沖劑；順鉑（20mg/支）購自齊魯制藥有限公司，用生理鹽水配成10%濃度。

1.2 細胞株 Lewis小鼠肺癌細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫，用含10%胎牛血清培養基培養并置于37℃、5%CO2的培養箱中。

1.3 動物 30只6周齡C57BL /6 雄性小鼠，體重（20±2）g，SPF 級，購自上海斯萊克實驗動物有 限 責 任 公 司（SCXK（滬）2017-0005），飼 養 于上海中醫藥大學動物實驗中心動物房（合格證號：20170005006029）。

1.4 試劑 胎牛血清、DMEM培養基、胰酶、PBS緩沖液，購自于美國GIBCO公司，TRAP染色試劑盒購自于美國Invitrogen公司，PCR引物由上海英濰捷基貿易有限公司合成，氯仿購自于國藥集團化學試劑有限公司，OPG一抗（YBio），RANKL一抗（Abcam），GAPDH一抗（CST），HRP標記山羊抗兔IgG（明睿生物），Trizol試劑盒購自于invitrogen，RT試劑（TAKARA Sybr green）購自于TAKARA公司，氯仿購自于國藥集團化學試劑有限公司等。

1.5 儀器 顯微鏡（CX41），日本奧林巴斯株式會社；熒光倒置顯微鏡 （DMI3000B），德國Leica公司；酶標儀（BioTek）；低溫冰箱（SANYOCO）；電泳儀（DYY-6D），北京六一生物；全自動化學發光/熒光圖像分析系統（上海天能科技）；通用型離心機Z366K（HERMLE）；高速冷凍離心機（centrifuge 5417R），德國EPPENDORF公司；低溫冰箱（MDF-292），SANYO 公司；高壓蒸氣消毒器（YXQ.SGH.280），上海醫用核子儀器廠等。

2 方法

2.1 分組 30只C57BL /6 雄性小鼠隨機分為5組，每組6只。空白對照組在左后肢股骨處注射等劑量PBS作假手術。其余4組（模型對照組、益腎固骨方組、順鉑組、聯合用藥組）均以Lewis肺癌細胞建立肺癌股骨局部骨轉移模型[7]：麻醉小鼠，左后肢股骨部位脫毛，剪開皮膚，暴露股骨端。從股骨下端用1ml注射器沿著股骨長軸方向旋轉進針，分別接種20uL/只 Lewis細胞懸液（含細胞1×106個）。注射完，稍留針后緩慢拔出，消毒縫合傷口。

2.2 給藥 造模后第2天起給予藥物干預，共21d。益腎固骨方組按每天3g/kg中藥顆粒劑劑量0.1mL/10g灌胃處理，順鉑組按隔日2mg/kg[8]腹腔注射順鉑劑量0.1mL/20g處理，聯合用藥組按每天3g/kg中藥顆粒劑劑量0.1mL/10g灌胃+2mg/kg腹腔注射順鉑劑量0.1mL/20g處理。其中模型對照組僅予等劑量及方法生理鹽水灌胃、腹腔注射處理。

3 檢測指標與方法

第22天，麻醉處死小鼠后分離左下肢股骨，每組隨機取3塊股骨組織放入液氮中保存備用，另外3塊股骨組織放入4%多聚甲醛固定48h，PBS沖洗，放入脫鈣液中進行3周的持續震蕩脫鈣，最后進行常規脫水、包埋。

3.1 TRAP染色法 將股骨組織切片烘干后，根據TRAP染色試劑盒說明指示進行，光鏡下（200倍）觀察破骨細胞形態和數量。陽性破骨細胞胞漿呈酒紅色，核呈陰性。

3.2 RT-PCR法 采用熒光實時定量PCR法檢測股骨OPG和RANKL mRNA。Trizol法提取定量骨組織總RNA，根據反轉錄試劑盒的說明進行逆轉錄。引物由上海英濰捷基貿易有限公司合成，引物序列見表1。熒光定量PCR儀設定如下條件進行擴增：95℃ 5s，60℃ 34s，40個循環。以GAPDH作為內參，對各組樣品進行校正后采用2-ΔΔCt法 （RQ值）計算各基因相對表達量。

表1 各基因引物序列

4 免疫組織化學法

檢測股骨組織中OPG、RANKL蛋白表達，按照免疫組織化學染色SP方法，先將切片脫蠟水化；然后PBS清洗5min后進行抗原修復；用3%H2O2滴加到切片上，封閉5～10min去除內源性過氧化物酶。PBS洗5min×3，3%過 氧 化 氧 孵 育10min，PBS洗5min×3，一抗作用37℃2h，PBS洗5min×3，二抗作用37℃Ih，PBS洗5min×3，顯色，復染，脫水透明，封片。在200倍顯微鏡視野下，統計棕色陽性物質的光密度值。

5 統計學方法

實驗數據采用SPSS 24.0統計軟件進行統計學處理。計量資料用±s表示，則采用單因素方差分析進行統計。P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 小鼠股骨組織TRAP病理

通過股骨病理切片觀察到各組骨組織的形態變化。空白對照組的骨組織病理切片顯示，骨結構完整，骨皮質連續，骨小梁排列規則，骨質內細胞完整。模型對照組的骨質破壞嚴重，骨質內可見2～3個被染成酒紅色的破骨細胞，排列紊亂，細胞核增大，異型性明顯。益腎固骨方組、順鉑組和聯合用藥組骨髓腔內可見少量破骨細胞，聯合用藥組骨破壞明顯減輕。見圖1。

圖1 各組小鼠股骨病理TRAP染色（×200）

2 小鼠股骨組織中RT-PCR法檢測結果

小鼠股骨組織進行RT-PCR法檢檢測結果顯示，與模型對照組比較，益腎固骨方組及聯合治療組OPG mRNA表達有所增加，但無明顯統計學意義（P＞0.05）。與模型對照組比較，順鉑組及聯合治療組RANKL mRNA表達呈下降趨勢，但無明顯統計學意義（P＞0.05）。與空白對照組比較，各造模組OPG、RANKL mRNA表達均明顯降低（P＜0.05），而OPG/RANGKL比值無明顯變化（P＞0.05）。（表2，圖2）

圖2 各組小鼠股骨RT-PCR法檢測結果

表2 各組小鼠股骨OPG和RANKL mRNA表達比較（±s）

表2 各組小鼠股骨OPG和RANKL mRNA表達比較（±s）

注：經LSD分析，與空白對照組比較，#P＜0.05

分組 例數 OPG RANKL OPG/RANKL空白對照組 30.46±0.47# 0.87±0.27# 0.51±0.44模型對照組 30.05±0.020.20±0.160.30±0.16益腎固骨方組 30.09±0.090.24±0.190.33±0.09順鉑組 30.03±0.010.07±0.020.54±0.09聯合用藥組 30.06±0.050.14±0.110.46±0.08

3 免疫組化檢測小鼠股骨OPG、RANKL蛋白的表達

與空白對照組比較，模型對照組、益腎固骨方組OPG蛋白表達上調，但無明顯統計學意義（P＞0.05）；與空白對照組比較，模型對照組、益腎固骨方組RANKL蛋白明顯上調（P＜0.05）。與模型對照組比較，順鉑組、聯合用藥組OPG蛋白表達明顯下調（P＜0.05），益腎固骨方組能上調OPG蛋白，但無明顯意義（P＞0.05）；與模型對照組比較，順鉑組和聯合用藥組能明顯下調RANKL蛋白（P＜0.05）。

表3 各組小鼠股骨OPG和RANKL 蛋白表達比較 （±s）

表3 各組小鼠股骨OPG和RANKL 蛋白表達比較 （±s）

注：經LSD分析，與空白對照組比較，DP＜0.01；與模型對照組比較，#P＜0.05；

分組 例數 OPG RANKL OPG/RANKL空白對照組 34.38±2.510.61±0.44# 9.75±5.39模型對照組 36.30±0.7422.12±6.46D 0.30±0.07益腎固骨方組 36.55±0.7017.47±2.45D 0.38±0.07順鉑組 31.33±0.97# 0.08±0.06# 27.4±26.14#聯合用藥組 32.86±2.71# 0.45±0.30# 9.31±8.80

圖3 各組小鼠股骨組織中蛋白表達（×200）

圖4 各組小鼠股骨組織中OPG、RANKL蛋白陽性面積

討論

肺癌屬中醫學“積聚”“肺積”范疇，《黃帝內經》云：“邪之所湊，其氣必虛”，肺癌發生發展與人體正氣的虛實密切相關。隨著年齡增長，正氣漸虛，腎氣衰敗，如《素問·上古天真論篇》曰：“女子七歲，腎氣盛，齒更發長……丈夫八歲，腎氣實，發長齒更 ……五八腎氣衰，發墜齒槁”。肺癌晚期，腎精虧虛，骨失所養，癌毒滯留骨所失養之處，日漸凝聚，痰濕瘀血日積，則發為骨轉移。中醫學中有腎主骨生髓理論，肺癌骨轉移當從益腎論治。上海市虹口區名中醫鐘薏教授在“扶正治癌”思想及“腎主骨”理論指導下提出“補腎法”治療肺癌腫瘤骨轉移。本次實驗采用益腎固方驗證，該方由熟地、山萸肉、骨碎補等組成，具有補益腎精，強骨止痛的功效，為“補腎法”臨床實踐的代表方，臨床療效良好。

對于其他轉移而言，骨轉移特點在于在于轉移灶是代謝活躍的骨組織。腫瘤骨轉移過程，除腫瘤細胞表現外，還包括骨微環境破壞與腫瘤細胞增殖通過釋放各種生長因子相互促進[9]，包括包括白細胞介素-6（interleukin-6，IL6）、轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、甲狀旁腺激素相關蛋白（parathyroid hormone-related protein，PTHrP）等。各種生長因子作用于成骨細胞，誘導OPG-RANKLRANK信號軸，進而影響破骨細胞，促進腫瘤細胞破骨進程，打破骨微環境平衡，誘導骨轉移。RANKL作為成骨細胞表達分泌的重要因子，存在于成骨細胞表面或者由成骨細胞分泌入骨微環境，主要起調節骨改建過程的作用[10]。OPG 通過與RANKL競爭性結合阻斷與RANK的結合，從而抑制骨吸收，維持骨代謝平衡，OPG/RANKL比值可作為衡量骨量及骨健康的重要指標[11]。RANK/RANKL/OPG信號的高表達與人類非小細胞肺癌骨轉移并形成溶骨性骨破壞的潛能有關[12]。文獻報道[13]，肺癌患者骨轉移后溶骨性癌組織中檢測到RANKL、OPG表達上調，同時發現RANKL與OPG呈高比值；實驗將重組人 RANKL和RANKL cDNA基因轉染后，觀察到OPG增加減弱，癌細胞向體內外轉移潛能和遷移能力明顯增強，文中揭示腫瘤細胞可能通過直接產生 RANKL或 OPG，或通過間接刺激成骨細胞/細胞基質分泌 RANKL或OPG的其他因子實現改變破骨細胞的活化能力。

本研究結果顯示，各治療組TRAP陽性的破骨細胞數量較模型對照組減少。與模型對照組比較，益腎固骨方與順鉑聯用時，能夠明顯下調RANKL蛋白表達（P＜0.05）；益腎固骨方組在一定程度能夠上調OPG蛋白及基因表達，但無統計學意義（P＞0.05）。因此推測，補腎法中藥對肺癌骨轉移模型具治療作用，其機制可能通過調節骨微環境，抑制RANKL的表達、增加OPG 表達從而抑制肺癌骨轉移的發展。本實驗僅針對骨微環境中成骨細胞與破骨細胞的OPG、RANKL表達開展研究，希望初步揭示補腎中藥通過改善腫瘤生存微環境，達到抑制腫瘤進展的目的。肺癌骨轉移后，癌細胞和骨組織微環境間進行復雜的相互作用，有多種相關信號通路參與其中，課題組未來也將進一步深入研究的，探索肺癌骨轉移后骨破壞過程的完整機制。