威爾遜病患者結構腦網絡的破壞*

殷紅曦，朱龍 ，王艷昕

1 安徽中醫藥大學研究生院 安徽合肥 230031 2 安徽中醫藥大學第一附屬醫院腦病科 安徽合肥 230031

威爾遜病（Wilson’s Disease，WD）是一種銅代謝障礙常染色體隱性遺傳性疾病，機體內過量的銅沉積在肝臟、大腦等多器官，可引起多種癥狀[1]。該病是由ATP7B基因純合或復合雜合突變導致銅代謝障礙，有毒銅的積累最終導致氧化應激和細胞死亡[2]。在WD患者中，ATP7B功能缺陷導致肝細胞銅超載，并伴有肝病理改變。過量的銅也被釋放到循環中，在其他組織中形成繼發性的病理積累，尤其是大腦，會導致神經癥狀和精神障礙。

在過去的20年里，大部分關于威爾遜病的研究主要集中在基因及其表達和臨床癥狀上。如McCann[3]等研究發現單核苷酸多態性具有可以調節ATP7B基因和機體銅狀態的特性。Wang等[4]發現WD的長期標準化治療可以有效地預防WD患者廣泛的腦損傷并減少癲癇的發生。Helmy等[5]發現WD患者在疾病的任何時間點和d-青霉胺治療期間均存在無癥狀性尿異常，早期干預可以阻止進展為腎功能不全。這可能是由于該病是罕見病以及檢測手段的限制。然而近些年來，隨著擴散張量成像（Diffusion tensor imaging，DTI）、靜息態功能磁共振成像（Resting-state functional Magnetic Resonance Imaging，rs-fMRI ）和腦網絡分析（Brain Network Analysis，BNA ）無創成像技術的迅速發展，一些研究者將其應用于WD的研究中。如王萍等[6]用磁共振擴散張量成像（DTI）技術評估肝豆狀核變性（HLD）丘腦損害的價值時，發現DTI可在常規MRI 信號改變之前用于評估 HLD丘腦損害，并可提供擴散信息的變化。張發平等[7]采用DTI和MRS相結合的技術，對WD病腦組織損害的定量研究。

現階段，使用現代的腦圖譜技術基于圖論的腦網絡研究越來越多，如基于功能磁共振成像（fMRI）和彌散張量成像（DTI）技術的腦網絡[8-10]研究。然而，以往的研究只關注大腦的局部變化，WD是否存在全局拓撲屬性改變，這在很大程度上是未知的。并且臨床上可見到有些WD患者出現記憶力、注意和計算等認知功能受損的情況，那么WD患者的認知情況與大腦網絡的全局拓撲特性之間是否存在相關性，我們也不清楚。為了找出這些問題的答案，我們采集了20名WD患者和15名健康對照者的DTI數據，利用圖論方法構建和分析結構腦網絡，觀察2組參與者大腦網絡全局指標的組間差異。

資料與方法

1 診斷標準

WD的診斷是由2名有經驗的臨床神經病學家專家根據2008年AASLD《肝豆狀核變性診斷和治療指南》的共識確定的[11]。

2 入組標準

2.1 納入標準 ①年齡13～45歲；②右利手；③首次診斷為WD病的患者或既往診斷為WD病但已經停止藥物治療1年以上者。

2.2 排除標準 ①有持續5min以上的意識障礙的頭部外傷史；②有藥物或酒精濫用史；③已懷孕史；④通過訪談和醫療記錄審查診斷的任何身體疾病，如心血管疾病或其他神經系統疾病。

3 一般資料

本研究共納入35例，包括20例WD患者和15例健康對照組。除此之外，所有參與者使用24項漢密爾頓抑郁量表（HAMD）[12]和14項漢密爾頓焦慮量表（HAMA）[13]診斷，排除焦慮和抑郁狀態。HAMD是對受試者抑郁程度進行評分，當分數＞8分，表明可能有抑郁，則予以排除；HAMA是對受試者焦慮程度進行評分，當分數＞7分，表明可能有焦慮，則予以排除。蒙特利爾認知評估量表（Montreal Cognitive Assessment，MoCA）[14]被用來評估患者的認知功能情況。本研究根據《赫爾辛基宣言》開展，并經安徽中醫藥大學第一附屬醫院醫學研究倫理委員會批準，在對本研究進行完整的描述后，每個受試者都簽署了書面知情同意書。

4 磁共振數據的采集

MRI數據采集使用3.0-Tesla MR系統（Discovery MR750， General Electric， Milwaukee， WI， USA）。用緊而舒適的泡沫墊來減少受試者的頭部運動，耳塞被用來減少掃描儀的噪音干擾。3DT1加權像圖像的獲取采用BRAVO序列，參數設置如下：重復時 間（TR）=8.16ms；回 波 時 間（TE）=3.18ms；反 轉時間（TI）=450ms；翻轉角（FA）=12°；視野（FOV）=256mm×256mm；矩陣=256×256；層厚=1mm，無層間距，掃描184失狀層；采集時間=357s。DTI數據采集采用SE-SS-EPI序列，參數為：TR/TE=5000/82.3ms；FOV=256mm×256mm；矩陣=128×128；平面分辨率=2mm×2mm；層厚=3mm，無層間距；掃描44軸層；25個非共線擴散梯度（b=1000s/mm2）和10個非擴散加權圖像（b=0s/mm2）;獲取時間=265s。所有受試者在MRI掃描時被要求閉上眼睛，放松，盡量少動，不去想任何特別的事情，但在掃描過程中不能睡著。所有MR圖像均經過目視檢查以確保準確無誤，在隨后的分析中只包括了沒有可見偽影的圖像。

5 DTI數據預處理

DTI預處理步驟使用分析腦擴散圖像的軟件包（PANDA， http://www.nitrc.org/projects/panda）[15]。具體來說，擴散加權圖像首先被配準到一個參考圖像上（即，第一個b0圖像），通過仿射變換使渦流和頭部運動造成的扭曲最小化。在剝顱骨后，我們估計了擴散張量的6個獨立成分，并據此計算出分數各向異性。然后，通過確定性追蹤算法，即連續追蹤纖維法（FACT），以獲得全腦纖維追蹤成像圖[16]。追蹤過程從深部白質區開始，以偏轉角大于50°或FA值小于0.2的體素時結束追蹤。

6 結構腦網絡的構建

在擴散圖像的本地空間中構建結構腦網絡，需要將MNI空間中的AAL模板轉變到個體空間上。簡單地說，首先將個體結構圖像配準到它們的第一個b0圖像。然后利用非線性扭曲算法對變換后的結構圖像進行分割、標準化到MNI空間。倒轉派生出的變形參數，將AAL模板從MNI空間轉變為擴散圖像本地空間上[17]。為了定義大腦結構網絡的邊，我們計算了任意一對節點之間的纖維數量（在纖維追蹤過程中，兩個節點都有端點），得到每個被試的90×90FN（fiber number，FN）矩陣（圖1）。考慮到DTI分辨率和FACT算法能力的局限性，可能會包含一些偽連接。為了盡可能減少偽連接的影響，將三條纖維束的閾值應用于所有的FN矩陣，即如果至少有三條纖維束存在，則認為兩個節點通過一條邊相連[18-20]。最后，以FN作為每條邊的權重構建結構加權腦網絡[21-23]。

圖1 用于構建HC（a）和WD（b）的結構加權腦網絡的結構連接（纖維束條數）矩陣

7 網絡分析

使用GRETNA軟件對結構腦網絡進行圖論分析（http://www.nitrc.org/projects/gretna）[24]。計 算 結 構加權腦網絡的全局網絡指標。小世界屬性是腦網絡最常用的指標，包括集聚系數（clustering coefficient，Cp）、特征性路徑長度（characteristic path length，Lp）、標準化集聚系數（normalized clustering coefficient，Gamma）、標 準 化 特 征 性 路 徑 長 度（normalized characteristic path length，Lambda）和小世界（smallworldness，Sigma）[25]。Cp是對網絡局部密度或集團化程度的度量，它代表網絡的分割。Lp是衡量網絡平均連接或總體效能的指標，它代表網絡的整合。通過對100個相匹配隨機腦網絡的平均集聚系數和特征性路徑長度進行縮放，這些隨機腦網絡與真實腦網絡具有相同數目的節點、邊和度值分布[26]，得到標準化的集聚系數Gamma和標準化的特征性路徑長度Lambda。這兩個度量值也可以總結為一個簡單的定量指標，即小世界，Sigma = Gamma/Lambda。

已經研究發現健康人大腦網絡具有最佳的小世界屬性，以相對較低的成本高效傳輸并行信息[27]。而網絡效率是一個從信息傳遞角度描述大腦網絡的相關指標[27，28]。因此，我們計算了受試者的全局和局部水平的腦網絡效率。全局效率（global efficiency，Eg）代表整個網絡并行信息傳輸的能力。局部效率（local efficiency，Eloc）代表網絡的容錯能力，它反映了當一個給定節點被消除時，該節點的鄰居之間的信息交流情況。

8 統計學分析

8.1 臨床變量的差異 統計分析采用SPSS21.0軟件包（SPSS， Chicago， Ill）進行。WD和HC組年齡的比較采用數值變量資料兩獨立樣本Wilcoxon秩和檢驗；而受教育程度則是通過數值變量資料兩個獨立樣本t檢驗來衡量的；組間的性別差異采用無序分類變量資料Fisher確切概率法。

8.2 網絡指標的差異 為了確定2組的腦網絡指標是否存在顯著的組間差異，對每個腦網絡指標（小世界和網絡效率）進行了非參數置換檢驗[29]。值得注意的是，在進行置換檢驗之前，我們使用了多重線性回歸分析來消除年齡、性別和受教育程度對每個腦網絡指標的混雜影響。

8.3 網絡指標和MoCA評分之間的關系 為了明確WD患者的認知情況與大腦網絡的全局拓撲特性之間是否存在相關，我們將WD患者的腦結構網絡指標值分別與WD患者的MoCA評分做相關分析。當WD患者的各個腦結構網絡指標值分別和MoCA評分數據做相關時，若同時滿足正態性時則使用Pearson相關系數分析，若不滿足正態性時則采用Spearman相關系數分析。考慮到分析的探索性，雙尾P＜0.05表示差異有統計學意義。

結果

1 人口統計學及臨床特征

WD組和HC組在年齡（Wilcoxon秩和檢驗，Z=-1.761，P=0.078）和 性 別（Fisher確 切 概 率 法，P=1.000）上沒有顯著差異。焦慮抑郁作為受試者的排除標準，HAMA和HAMD均無明顯差異。同健康對照相比較，WD患者的MoCA評分明顯偏低（Wilcoxon秩和檢驗，Z=-4.503，P＜0.001）。而WD患者的受教育程度較健康人低（雙樣本t檢驗，t=3.284，P=0.002）。見表1。

表1 人口統計學和臨床特征比較

2 結構腦網絡全局指標的組間差異

在3條纖維束的閾值下，通過使用GRETNA軟件的雙樣本t檢驗，結果發現相對于隨機腦網絡，WD和HC組的結構腦網絡具有更高的集聚系數（GammaHC= 4.060±0.547，GammaWD = 4.294±0.437），但幾乎相同的特征路徑長度（LambdaHC = 1.116±0.030，LambdaWD= 1.139±0.053），這表明2組的結構腦網絡均表現出典型的小世界拓撲屬性。WD組和HC組之間結構加權腦網絡全局指標的差異。與HC組相比，WD患者結構腦網絡的Cp、Lp明顯增加，Eg、Eloc明顯減少，而2組的Gamma、Lambd和Sigma之間無顯著組間差異（P＞0.05）。見圖2。

圖2 2組之間結構加權腦網絡全局指標差異

3 全局網絡指標與MoCA評分之間的關系

通過對WD患者的各個腦結構網絡指標值和MoCA量表評分做相關，發現Cp（Pearson相關，r = - 0.225，p = 0.339）、Sigma（Pearson相關，r = - 0.297，p = 0.203）與MoCA量表評分均無相關性；而Lp與MoCA量表評分呈現出（Spearman相關，r = - 0.673，p = 0.001）負相關，而Eg（Pearson相關，r =0.561，p = 0.010）與MoCA量表評分呈現出正相關、Eloc（Pearson相關，r = 0.530，p = 0.016）與MoCA量表評分也呈現出正相關，見圖3散點圖示。

圖3 全局網絡指標與MoCA量表評分之間的相關性

討論

人類的大腦是由各個功能的網絡組成的復雜網絡的集合，包括默認網絡、執行控制網絡、凸顯網絡、背側注意網絡、腹側注意網絡、感覺運動網絡、視覺網絡和聽覺網絡等。默認網絡主要負責自我相關認知，包括對情緒的處理，既往的體驗等；執行控制網絡多與情緒相關，并參與腦的高級認知功能等；凸顯網絡負責監測身體內外部的突發事件或刺激，以及默認網絡和執行控制網絡之間的動態切換功能等；背側注意網絡負責主動注意功能，自上而下的控制；腹側注意網絡則是通過刺激驅動的控制，屬于被動的注意；感覺運動網絡負責軀體的感覺和運動功能；視覺網絡和聽覺網絡則分別負責視覺信息、聽覺信息的的處理。而我們通過對WD患者全腦網絡的分析研究，從大腦微觀角度闡述WD患者結構腦網絡的變化情況。

基于圖論的復雜網絡分析已被應用于量化大腦網絡，這些網絡具有豐富的神經生物學意義和易于計算的指標[30]。根據圖論，大腦可以被描述成一個圖，這個圖由許多節點組成，這些節點由一組邊連接起來，其中節點代表大腦區域，甚至是體素，邊則代表由靜息態功能磁共振測量的功能連接值或由擴散張量成像確定性追蹤或概率性追蹤的纖維束[31-33]。通過這些方法，研究者們發現人類大腦的結構和功能腦網絡都具有最佳的小世界拓撲結構[34-35]，其特征是大腦區域間高度的局部特性和高度的全局整合，以相對較低的成本高效率傳輸并行信息[34，36-37]。腦網絡的全局度量通常以多種方式表示，如小世界屬性和網絡效率，這些指標是對信息處理的整合和分離能力不同程度的量化，反映并行信息傳輸的能力，且對網絡的容錯性進行了表述[30]。

人腦在結構和功能上是一個復雜的網絡，具有典型的小世界拓撲屬性，即具有高集聚系數和較短的最短路徑，這有利于信息處理的分離和整合[36]。最短路徑刻描述的是網絡中兩個節點之間信息傳遞的最優路徑，通過這種最優路徑可以更快的傳輸信息，從而節省資源，它和全局效率一起，共同度量全腦網絡長距離傳輸信息能力的強弱，即最短路徑越短，全局效率越高，長程信息傳遞越快。集聚系數是衡量網絡集團化程度的指標，它和局部效率一起，共同度量網絡間短距離傳輸信息能力的強弱，即集聚系數越高，局部效率越高，局部信息傳遞越快。當集聚系數和最短路徑都增大時，則人腦原本最佳的小世界網絡，有朝正則網絡轉變的趨勢；同樣的，當集聚系數和最短路徑都減小時，則有朝隨機網絡轉變的趨勢；這兩種網絡都不能最優的傳遞信息。

我們的研究發現WD患者的集聚系數和特征性路徑長度都增加，表明WD患者的大腦網絡有朝正則網絡轉變的趨勢，說明WD患者的大腦網絡結構已經開始被破壞，并且全局效率和局部效率的降低，也從另外一個角度反映出WD患者的大腦網絡結構被破壞。我們的研究結果和之前的對子網絡的研究結果相呼應。如Han[38]等使用基于后扣帶回皮層（PCC）的種子功能連接分析和圖論腦網絡分析工具研究了默認模式網絡（DMN）功能連接模式，發現同正常對照（NC）相比，WD患者改變了DMN的功能連接性并降低了局部和全局網絡效率，表明網絡間信息傳遞的能力受損。韓永升[39]等發現WD患者的眾多腦區存在腦灰質和白質異常，WD患者的默認網絡（DMN）和額-頂注意網絡（FPAN）存在功能連接異常，這些異常可能是注意網絡警覺效率受損的原因之一；WD患者存在全腦網絡功能連接異常，這些網絡連接異常可能是WD患者心理理論受損和共情能力下降的主要原因之一。

通過對WD患者的各個腦結構網絡指標值和MoCA量表評分做相關，我們還發現Lp與MoCA量表評分呈負相關，表明特征性路徑程度越長，MoCA評分就越低，說明WD患者的認知損害程度就越重；而Eg、Eloc與MoCA量表評分呈正相關，表明腦網絡全局和局部傳遞信息的能力越低，MoCA評分就越低，也說明了WD患者的認知損害程度就越嚴重。或許正是由于WD患者大腦網絡結構逐漸被破壞，信息傳遞能力下降，許多患者出現學習、記憶、計算等認知功能障礙而很早就結束了學業，進而出現受教育程度偏低的現象。我們的結果和先前的幾項研究結果相一致。如Arguedas[40]等通過對WD伴神經系統癥狀與肝臟癥狀患者的神經心理學比較研究，發現WD伴神經系統癥狀的患者除出現視覺和語言記憶、工作記憶和注意力下降外，執行功能障礙的各個方面也很明顯；并且WD伴肝臟癥狀的患者也出現了言語記憶困難和執行功能障礙認知損害的證據。Peyroux[41]等發現有神經系統癥狀和非神經系統癥狀的WD患者，在情緒識別、心理理論和歸因方式方面的社會認識損害不盡相同。Takeuchi[42]等利用低頻振幅（ALFF）和局部一致性（ReHo）方法分析研究發現在休息期間，工作記憶訓練誘導了自發性大腦活動以及大腦主要網絡區域中的全局和局部信息處理的可塑性，表明工作記憶訓練可以改善認知功能。

在這項研究中有幾個局限性。首先，威爾遜病是一種罕見的疾病，加上我們的納入標準較為嚴格，使得我們的樣本量偏少，為了排除受試者數量對我們結果的影響，我們將在未來招募更多的志愿者加以驗證。其次，本研究中DTI的分辨率較低（25個方向），這可能會影響基于擴散張量的確定性追蹤方法結果的魯棒性，未來可嘗試采集64個梯度方向的數據加以研究。最后，我們使用AAL模板將整個大腦分割成90個區域進行大腦網絡構建，而有些研究指出，不同的分割方案下的節點定義可能會導致圖論指標出現較大的差異[43-45]，在未來的研究中，將用不同的分割方案來檢測我們的發現。