高分辨率顯微內鏡對食管鱗狀細胞癌標本的成像研究*

舒娟，屈亞威，談濤，張玲，劉敏黎，劉海峰

（1.遼寧醫學院武警總醫院研究生培養基地，北京100039；2.武警總醫院消化科，北京100039）

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高分辨率顯微內鏡對食管鱗狀細胞癌標本的成像研究*

舒娟1，屈亞威2，談濤2，張玲2，劉敏黎2，劉海峰2

（1.遼寧醫學院武警總醫院研究生培養基地，北京100039；2.武警總醫院消化科，北京100039）

摘要：目的探索高分辨率顯微內鏡（HRME）對食管鱗狀細胞癌（ESCC）標本成像的可行性。方法回顧性分析24例ESCC大體標本的正常食管黏膜和ESCC組織的HRME圖片，總結圖片特點，制定正常食管黏膜和ESCC組織的HRME診斷標準。在此基礎上，對60例內鏡下疑診為鱗狀細胞癌的活檢標本進行HRME前瞻性研究，將HRME預診斷結果與病理結果比較，評估HRME對食管鱗狀細胞癌的診斷價值。結果正常食管黏膜HRME特點為：細胞排列規則，細胞核圓而亮，大小一致，核間距正常，視野里細胞的數量基本一致；ESCC組織HRME特點為：細胞排列極其紊亂，失去極性，細胞核大小不一，核間距減小，出現了大量細胞核的疊加，細胞核增大，每個視野中都為雜亂分布的細胞核。對60例內鏡下疑診為ESCC的活檢標本HRME成像后，HRME預診斷為正常食管黏膜4個，鱗狀細胞癌52個，其他4個。病理檢查后，診斷為正常食管黏膜3個，鱗狀細胞癌53個，其他4個。經統計學分析，HRME對鱗狀細胞癌診斷的敏感度、特異度、準確性、陰性預測值和陽性預測值分別為96.2%、85.7%、95.0%、75.0%和98.1%。結論HRME可以很好地區分正常食管黏膜和鱗狀細胞癌組織，其能很好的對鱗狀細胞癌標本進行成像。

關鍵詞：高分辨率顯微內鏡；食管鱗狀細胞癌標本；成像研究

食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是最常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅著人類的生命健康［1］。目前，內鏡檢查結合組織活檢是診斷ESCC的金標準，但該診斷方法也有其局限性，如對內鏡下疑診為食管癌的患者需多部位取活檢以免造成病變的漏診，會造成許多不必要的活檢，這不僅增加了患者檢查風險和費用，也延長了檢查時間［2-4］。因此，需要一種新的內鏡成像技術，能夠在內鏡檢查的同時能快速、準確且無創的做出病理學成像，這對內鏡醫師的即時診斷和患者的及時治療具有重要意義。近年來，本組自主研發了一種新型的能進行即時組織病理成像的高分辨率顯微內鏡（high resolution microendoscopy，HRME）成像設備，這是一種新的即時組織病理學成像技術，前期研究結果表明，HRME能很好地區分消化道不同部位的正常黏膜，可以實現虛擬病理學成像。前期研究結果令人鼓舞，然而HRME對ESCC的成像研究國內尚未見相關報道。本研究擬使用HRME對ESCC大體標本進行成像觀察，制定正常食管黏膜和鱗狀細胞癌組織的HRME診斷標準。在此基礎上，利用HRME對內鏡下疑診為ESCC的活檢標本進行前瞻性研究，評估HRME對ESCC的診斷價值。

1　資料和方法

1.1一般資料

1.1.1研究對象包括2014年12月-2015年3月因ESCC就診于本院胸外科行手術切除的大體標本24例和2015年3月-2015年9月就診于本院消化內鏡中心行內鏡檢查時疑診為ESCC的活檢標本60例為研究對象。所有患者均簽署知情同意書。

1.1.2試劑和藥品0.01%原黃素鹽酸鹽（美國Sigma公司）、0.9%生理鹽水（辰欣藥業股份有限公司）、鏈霉蛋白酶顆粒（北京泰德制藥股份有限公司）和碳酸氫鈉（北京泰德制藥股份有限公司）等。

1.1.3成像設備自主研發的HRME成像系統，包括1根含30 000像元的長1.8 m的光纖、10×顯微鏡鏡頭、500 nm二向色鏡、濾光片、三維組合平移臺、科學級低溫制冷CCD相機和計算機圖像處理軟件，成像過程中HRME攝取的圖像以17幀/s的速度由CCD相機傳輸至計算機。見圖1。

1.2研究方法

1.2.1標本的獲取對于大體標本，選擇腫瘤組織及切緣附近的正常食管黏膜的標本用于本研究中診斷標準的制定。對于內鏡下疑診為ESCC的患者，常規行組織活檢。選擇組織較完整、表面殘渣少的活檢標本用于前瞻性研究。

圖1　HRME結構原理圖和實物圖

1.2.2標本預處理活檢標本和大體標本均先用生理鹽水緩慢沖洗，去除表面殘留物；再用去黏液劑（鏈蛋白酶和碳酸氫鈉混合溶液）沖洗，去除表面殘留黏液。再次使用生理鹽水沖洗，去除表面殘留的去黏液劑，干棉球擦干，備用。

1.2.3HRME成像過程將組織展平置于成像板上，局部噴灑0.01%原黃素鹽酸鹽2.0～3.0 ml，染色劑在組織表面大約停留30 s后用緩沖鹽水沖洗表面殘留染料，干棉球輕輕擦干組織表面液體。將光纖頭端以不同角度觀察組織表面，留取清晰的圖片用于分析。對于大體標本，在HRME的成像位點用光纖做一個壓痕，以保證成像位點與活檢位點一致。1.2.4病理檢查HRME成像結束后，將所有成像后的活檢標本用福爾馬林固定，HE染色后常規病理學診斷。

1.3HRME圖片質量控制

對于所得HRME圖片進行嚴格篩查，每個標本留取質量最好的10張圖片用于圖片分析。篩查標準：①偽影面積未超過圖像面積的30%；②沒有大量的雜質覆蓋在組織表面；③圖片清晰且可視面積大于80%。

1.4HRME診斷標準的制定

由2名具有豐富放大內鏡診斷經驗的內鏡主治醫師回顧性分析24例ESCC大體標本的正常食管黏膜和鱗狀細胞癌組織的HRME圖片特征，包括細胞核大小、形態、排列方式、核間距和核密度等指標，如果他們出現意見不一致時則進行討論，最終達成一致意見，最后制定正常食管黏膜和鱗狀細胞癌組織的HRME診斷標準。

1.5HRME對ESCC診斷的前瞻性研究

根據上述制定的診斷標準，由2名不知病理結果與內鏡診斷結果的內鏡主治醫師對60個活檢標本的HRME圖片進行預診斷，包括ESCC、正常食管黏膜和其他3部分。以病理結果為金標準，評估HRME對ESCC的診斷價值。

1.6統計學方法

應用SPSS 17.0統計軟件進行數據處理。計數資料按照四格表法進行統計，計算HRME對ESCC診斷的敏感度、特異度、準確性、陽性預測值（positive predictive value，PPV）和陰性預測值（negative predictive value，NPV）。

2　結果

2.1一般情況

24例大體標本中，包括潰瘍型9例、腫塊型11例和縮窄型4例，病理檢查后，診斷為中-高分化鱗癌4例、中分化鱗癌13例和中-低分化鱗癌7例，HRME成像的正常食道黏膜經病理檢查后證實為正常黏膜。60例活檢標本中，包括潰瘍型27例、腫塊型28例和縮窄型5例。

2.2HRME圖片選擇

24例大體標本共獲得954張圖片，經篩查后，留取480張圖片用于制定HRME診斷標準，占50.3%。60例活檢標本共獲得1165張圖片，經篩查后，留取600張圖片用于HRME前瞻性研究，占51.5%。

2.3HRME診斷標準的制定

HRME通過觀察細胞核大小、形態、排列方式、核間距、核密度等指標來區分正常食管黏膜和病變組織。具體見圖2所示。正常食管黏膜：細胞排列規則，細胞核圓而亮，大小一致，核間距正常，視野里細胞的數量基本一致；ESCC：細胞排列極其紊亂，失去極性，細胞核大小不一，核間距減小，出現了大量的細胞核疊加，細胞核增大，每個視野中都為雜亂分布的細胞核。

圖2　正常食管黏膜和ESCC組織的HRME和相應病理圖片

2.4HRME前瞻性研究結果

利用HRME對60個成像位點成像后，根據前期制定的診斷標準，做出預診斷。HRME預診斷結果：正常食管黏膜4例，ESCC 52例，其他4例。病理檢查后，診斷為正常食管黏膜3例，ESCC 53例，其他4例。經統計學分析，HRME對ESCC診斷的敏感度、特異度、準確性、陰性預測值和陽性預測值分別為96.2%、85.7%、95.0%、75.0%和98.1%。見表1 和2。

表1　HRME預診斷結果與病理診斷結果比較　例

表2　HRME對ESCC診斷結果例

3　討論

分子影像學技術是近年來廣泛應用于科研和臨床的一種成像方法，與傳統的解剖學成像模式不同，分子成像技術可以實現細胞水平的功能成像［5-7］。代表性的成像方法有正電子斷層成像（positron emission computed tomography，PET）、單光子斷層成像（single-photon emission computed tomography，SPECT）、共聚焦激光顯微內鏡（confocal laser endomicroscopy，CLE）和HRME等。對于PET、SPECT和CLE等的基礎和臨床研究取得了顯著的成果，而對于HRME的研究尚處于臨床前的起步階段。

HRME是一種新的分子成像技術，能夠對組織進行實時成像，從而實現細胞水平的組織成像［8-11］。HRME的成像原理是通過LED光源發出的激發光經濾光片過濾，形成455 nm的窄譜段激發光，經高分辨率光纖傳導至噴灑染色劑的生物組織產生515 nm激發熒光。熒光信號再通過高分辨率光纖返回，由物鏡放大，通過二向色鏡將激發光和熒光分開，只將熒光傳導至CCD芯片上進行成像，從而得到被檢測組織的細胞學圖像。該成像系統成像直徑為720.0μm，空間分辨率為4.4μm，攝像速度為17 幀/s。近年來，國外學者對HRME進行了一些成像研究，結果表明HRME具有良好的應用前景［12-15］。借鑒國外學者的研究經驗，本研究自主研制了一套HRME成像系統，并進行裸鼠移植瘤、人口腔黏膜、家兔胃腸道黏膜和人體消化道正常黏膜的成像研究，取得了很好的成像效果，這為進一步臨床研究奠定了基礎。

在前期研究基礎上，本組進行了HRME對ESCC成像的可行性研究。研究中首次提出了ESCC的HRME診斷標準，表現為：細胞排列極其紊亂，失去極性，細胞核大小不一，核間距減小，出現了大量的細胞核的疊加，細胞核增大，每個視野中都為雜亂分布的細胞核。HREM對ESCC診斷標準的建立主要根據細胞排列方式和細胞核大小、形態及核間距等指標，這與組織病理學診斷依據一致，具有很高的可信度。為了進一步驗證該診斷標準的可行性和準確性，本組對內鏡下疑診為ESCC的活檢標本進行了前瞻性研究，根據制定的診斷標準，HRME對ESCC診斷敏感度、特異度和準確性分別為96.2%、85.7% 和95.0%，與病理比較具有較高的一致性，前瞻性研究結果也進一步證實了該診斷標準的可靠性。

本研究發現，部分診斷結果為其他的標本的HRME圖片不同于ESCC和正常食管黏膜，特點介于兩者之間，后經病理證實為癌前病變。目前本研究尚未對食管癌前病變進行回顧性研究，只是區分了正常食管黏膜和ESCC組織。對于癌前病變的相關研究，將是后續研究的重點，這有助于揭示正常黏膜-癌前病變-癌的序貫變化過程，對于探索食管癌的發生、發展具有重要意義。

上述研究結果展現了HRME對食管鱗狀細胞癌診斷的良好應用前景，但本研究也有一些局限性，如：①本研究僅對活檢標本進行成像，還未對在體組織進行成像，下一步準備改進成像設備對在體組織進行成像；②本裝置為小視野成像，其視場直徑僅為720.0μm，只能輔助寬視野內鏡對病變性質做出進一步診斷；③本成像設備還不能對所觀察組織的圖片進行定量分析，定量分析軟件還在研發中，目前對病變的診斷僅能靠內鏡醫師的主觀判斷，帶有一定的主觀性。

綜上所述，HRME作為一種新興的成像工具，可以對組織進行實時病理學成像［12-18］，從而很好地區分正常食管黏膜和ESCC組織，具有良好的應用前景。HRME作為一種即時的顯微成像工具，可以在內鏡檢查的同時做出即時病理學診斷，這對于提高病變診斷準確性具有重要意義。

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（吳靜編輯）

High resolution microendoscopy for esophageal squamous cell carcinoma specimens*

Juan Shu1，Ya-wei Qu2，Tao Tan2，Ling Zhang2，Min-li Liu2，Hai-feng Liu2
（1.Department of Gastroenterology，Liaoning Medical University and the General Hospital of Chinese People's Armed Police Forces on establishment of unit raising base for postgraduate education，Beijing 100039，China；2.Department of Gastroenterology，General Hospital of Chinese People's Armed Police Forces，Beijing 100039，China）

Abstract：Objective To explore the feasibility of high resolution microendoscopy in the imaging of esophageal squamous cell carcinoma specimen. Methods Retrospective analysis of 24 cases of esophageal squamous cell carcinoma of the gross specimens of normal esophageal mucosa and squamous cell carcinoma tissues HRME images，summarizes the image characteristics，develop HRME of normal esophageal mucosa and squamous cell carcinoma tissue diagnosis standard. Based on the developed diagnostic criter，we made a prospective study and the specimen from the suspected of squamous cell carcinoma in 60 cases. Comparing the prepressing diagnosis of HRME with the pathological results，aiming to evaluate the diagnostic value of HRME for ESCC. Results The characteristic of normal esophageal mucosa of HRME images：cells were arranged in an orderly manner，the nucleus was round，light and identical in size，the inter-nuclear distance was normal，and the number of cells in each field was similar；The diagnostic criteria for ESCC were as follows：cell arrangement was significantly disordered，cells had no polarity，the nuclei were of different sizes，inter-nuclear distance was reduced，nuclear overlapping was found in a large number of cells，the nuclei were enlarged，and disordered distribution of the nuclei was observed in each field. After imag－book=11,ebook=16ing，HRME was diagnosed as normal esophageal mucosa at 4 sites，squamous cell carcinoma at 52 sites，and the other at 4 sites. After pathological examination，the diagnosis normal esophageal mucosa was 3，squamous cell carcinoma was 53 and the other was 4. The sensitivity，specificity，accuracy，negative predictive value and positive predictive value of HRME in the diagnosis of squamous cell carcinoma were 96.2%，85.7%，75.0%，95.0%，98.1%，respectively. Conclusions HRME can distinguish normal esophageal mucosa and squamous cell carcinoma tissues and it can be used for imaging of squamous cell carcinoma specimen.

Keywords：high resolution endoscopy；esophageal squamous cell carcinoma specimen；imaging analysis

中圖分類號：R735.1

文獻標識碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1007-1989.2016.04.003

文章編號：1007-1989（2016）04-0010-05

收稿日期：2015-12-07

*基金項目：首都臨床特色應用研究（No：Z141107002514099）

［通信作者］劉海峰，E-mail：haifengliu333@163.com