結(jié)核分枝桿菌/利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術(shù)在脊柱結(jié)核檢測中的應(yīng)用

王新剛，衛(wèi)建民，楊俊松，王自立，馮萬立，夏斌，呂會強

(寶雞市中醫(yī)醫(yī)院脊柱骨病二科，陜西寶雞 721001)

脊柱結(jié)核約占所有結(jié)核病患者的1%～3%、骨關(guān)節(jié)結(jié)核的50%，是導(dǎo)致脊柱畸形甚至截癱的主要原因[1]?？菇Y(jié)核化療是治療脊柱結(jié)核的基礎(chǔ)，早期診斷和確定結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)的藥物敏感性有助于降低初治失敗和局部結(jié)核復(fù)發(fā)的風(fēng)險[2]。基于分枝桿菌液體培養(yǎng)系統(tǒng)的表型藥敏試驗(phenotypic susceptibility test,pDST)和應(yīng)用Lo-westein-Jensen(LJ)培養(yǎng)基的絕對濃度法是診斷耐藥結(jié)核(drug-resistant tuberculosis,DR-TB)的傳統(tǒng)方式，但存在診斷時間長的缺點，易延誤脊柱結(jié)核治療，進一步導(dǎo)致獲得性耐藥[3]。結(jié)核分枝桿菌/利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術(shù)(GeneXpert Mycobacterium tuberculosis/Rifampin,Xpert MTB/RIF)是基于MTB核酸擴增的自動化分子檢測方法，檢測過程僅需2 h，可同時檢測利福平耐藥MTB中的MTB特異核酸和rpoB基因突變，世界衛(wèi)生組織建議將其作為結(jié)核病快速診斷的方法[4]。近年來國內(nèi)外學(xué)者嘗試將Xpert MTB/RIF技術(shù)用于骨關(guān)節(jié)結(jié)核的診斷和治療，結(jié)果表明，利福平-DR試驗具有較高的敏感性和特異性，但MTB試驗敏感性中等[5-6]。鑒于脊柱結(jié)核臨床標本異質(zhì)性高、細菌數(shù)量少、需要積極行術(shù)前抗結(jié)核治療等特點，可能會降低診斷敏感性，因此，本研究通過比較不同脊柱病變組織標本的細菌培養(yǎng)、pDST、Xpert MTB/RIF陽性率，旨在為脊柱結(jié)核的臨床診斷提供參考，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2015年1月～2019年8月在本院就診的127例脊柱結(jié)核患者，納入手術(shù)切除的膿液108份，干酪樣組織94份，肉芽組織99份，共計301份標本。將病變硬塊組織徹底粉碎后，在3000轉(zhuǎn)/min條件下離心20 min，取沉淀物分作2份，儲存于-80℃，一部分用于細菌培養(yǎng)和pDST，另一份用來進行Xpert MTB/RIF檢測。

1.2 表型藥敏試驗

使用BACTEC MGIT 960分歧桿菌液體培養(yǎng)系統(tǒng)和LJ培養(yǎng)基絕對濃度法分別培養(yǎng)分枝桿菌對陽性標本進行培養(yǎng)鑒定，以LJ絕對濃度法測定11種抗結(jié)核藥物的pDST。11種藥物的臨界濃度分別為異煙肼(1,10 mg/mL)、利福平(50,250 mg/mL)、鏈霉素(0,100 mg/L)、乙胺丁醇(5,50 mg/mL)、左氧氟沙星(5,50 mg/mL)、4-氨基水楊酸(1,10 mg/mL)、丙硫異煙胺(25,100 mg/mL)、帕西尼嗪(0.1,1 mg/mL)、利福噴丁(50,250 mg/mL)、阿米卡星(10,100 mg/mL)、卷曲霉素(10,100 mg/mL)。

1.3 Xpert-MTB/RIF分析

根據(jù)Xpert MTB/RIF操作說明，收集500 μL沉淀物添加到1.5 mL試樣液體中，混合后在室溫下孵育15 min，添加到樣品箱中，然后將樣品箱加入4通道基因Xpert平臺中進行自動操作，約2 h即可在檢測軟件窗口直接讀取結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0軟件包進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料采用率或百分比表示，采用x2檢驗，以培養(yǎng)物和pDST為金標準，計算同一標本細菌培養(yǎng)和Xpert-MTB/RIF檢測的敏感度，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

膿液、干酪樣和肉芽組織細菌培養(yǎng)陽性患者60例，陽性率47.24%。其中，膿液陽性56例，干酪樣陽性47例，肉芽組織陽性35例；共301份標本中，培養(yǎng)陽性138份，陽性率45.85%。膿液標本和干酪樣標本的培養(yǎng)陽性率均顯著高于肉芽組織(P<0.05)。

Xpert MTB/RIF檢測膿液、干酪樣標本和總標本陽性率均顯著高于細菌培養(yǎng)(P<0.05)；兩種方法檢測膿液、干酪樣標本的陽性率均高于肉芽組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。60例細菌培養(yǎng)陽性的患者中，58例利用Xpert MTB/RIF法檢測陽性，敏感度為96.67%；67例細菌培養(yǎng)陰性的患者，36例Xpert MTB/RIF法檢測陽性，敏感度為53.73%，見表2。

表1 不同組織培養(yǎng)陽性率比較

表2 Xpert MTB/RIF檢測MTB的敏感性

60例細菌培養(yǎng)陽性的患者中，利福平耐藥27例(45%)，Xpert MTB/RIF檢測MTB均陽性，Xpert MTB/RIF檢測利福平耐藥26例，敏感度為96.30%；33例細菌培養(yǎng)非利福平耐藥者中，有2例Xpert MTB/RIF檢測MTB陰性，剩余31例細菌培養(yǎng)非利福平耐藥者中Xpert MTB/RIF檢測利福平耐藥2例，特異性為93.54%。 見表3。

表3 Xpert MTB/RIF檢測利福平DR的敏感性和特異性

3 討論

脊柱耐藥結(jié)核很難治愈，易復(fù)發(fā)，需要長期個體化化療、早期診斷和藥敏試驗(drug sensitivity test，DST)，才能達到有效的疾病維持。既往研究中，通常需數(shù)周時間才能完成細菌培養(yǎng)和DST，陽性率為10%～60%，此期間不當(dāng)?shù)目菇Y(jié)核化療可導(dǎo)致獲得性耐藥和局部復(fù)發(fā)[7]。與痰標本相比較，脊柱結(jié)核臨床標本異質(zhì)性高、細菌計數(shù)少、標本預(yù)處理要求高、采集難度大、針吸活檢采集標本困難，基因芯片、線性探針等分子診斷技術(shù)雖然可提高敏感度，但加重患者經(jīng)濟負擔(dān)，而且操作復(fù)雜，對實驗室環(huán)境和技術(shù)人員要求較高。因此，開發(fā)簡便、高效、準確的脊柱結(jié)核診斷方法和耐藥性診斷方法具有重要意義[8]。

基于PCR的分子診斷是結(jié)核病和耐藥性有效的診斷方法，自2010年世界衛(wèi)生組織建議使用Xpert MTB/RIF快速檢測以來，得到了較大范圍的推廣應(yīng)用[9]。既往研究顯示，Xpert MTB/RIF法對骨關(guān)節(jié)結(jié)核檢查的敏感性為63.57%～95.60%，特異性為96.20%～100.00%，Xpert MTB/RIF法對利福平耐藥的敏感性為93.33%～100%，特異性為94.12%～100%[10-11]。Xpert MTB/RIF檢測最大程度簡化了MTB的檢測，操作簡單、檢測結(jié)果可靠，靈敏度和特異性高[12]。本研究對符合NICE2011骨關(guān)節(jié)結(jié)核臨床診斷標準的脊柱結(jié)核患者，采集其膿液、干酪壞死組織和肉芽組織，制備不同類型的標本，結(jié)果顯示，Xpert MTB/RIF法檢測MTB的總陽性率顯著高于細菌培養(yǎng)，對膿液和干酪樣標本檢查的陽性率均顯著高于細菌培養(yǎng)，而以細菌培養(yǎng)和pDST為金標準檢測的敏感度為96.67%，敏感度較高。這些結(jié)果提示，Xpert MTB/RIF法對脊柱結(jié)核標本，尤其是對膿液和干酪樣標本的敏感性高于細菌培養(yǎng)法。

Xpert MTB/RIF分析依賴于標本中的MTB-DNA含量，而BACTEC-MGIT-960培養(yǎng)依賴于活菌計數(shù)。Dong等[13]對50例經(jīng)病理證實的脊柱和關(guān)節(jié)結(jié)核患者術(shù)后經(jīng)BACTEC-MGIT-960培養(yǎng)的標本檢測中，死骨陽性率為41.9%，膿液陽性率為40.0%，肉芽組織陽性率為33.3%，提示不同類型組織標本活菌數(shù)存在差異。Li等[14]對43例經(jīng)病理證實患有晚期關(guān)節(jié)結(jié)核的患者進行研究，該研究收集43份術(shù)后標本，進行了基于PCR的熒光檢測，肉芽組織陽性率為74.42%，高于干酪樣組織的58.14%和膿液的37.21%，結(jié)果提示不同組織間MTB-DNA含量存在差異。目前對脊柱結(jié)核不同組織標本檢測的差異較少見報道，本研究結(jié)果顯示，在Xpert MTB/RIF法和細菌培養(yǎng)法中，膿液陽性率均高于肉芽組織和干酪樣組織，結(jié)果提示臨床穿刺收集膿液有利于早期病菌的檢測。

綜上所述，Xpert MTB/RIF在脊柱結(jié)核標本檢驗中有較高的敏感性，收集脊柱結(jié)核患者的各種標本尤其是膿液標本，使用Xpert MTB/RIF可方便、快速、準確地診斷結(jié)核感染和DR，值得臨床推廣應(yīng)用。