肌腱蛋白C與肝移植術后肝損傷的關系及其檢測的價值*

曹薇薇，楊佩軍，李 霄△

1.安康職業技術學院，陜西安康 725000；2.空軍軍醫大學西京醫院肝膽外科，陜西西安 710032

肝移植是終末期肝臟疾病和小細胞肝癌的有效治療方法，其手術技術和圍術期管理措施已較為完善，但由于供肝的熱缺血、冷缺血、再植入及開放血流后的再灌注等過程均會對移植肝組織造成損傷，故術后早期移植肝損傷仍是無法避免的難題之一，嚴重時可誘發移植肝早期喪失功能，導致移植失敗[1]。移植肝早期損傷的病理生理過程較復雜，涉及免疫損傷、炎癥損傷和缺血-再灌注損傷(IRI)等多個環節，因此預判其損傷程度和臨床結局較為困難，缺少敏感的預測標志物。肌腱蛋白C(TNC)是細胞外基質中具有獨特的六臂體結構的寡聚糖蛋白家族成員，其在體內的分布較為廣泛，包括肝臟、腸組織、軟骨膜、骨膜、平滑肌及部分神經組織。生理情況下，TNC參與上皮細胞的眾多生理調節過程，如黏附、增殖、遷移、分化和凋亡等[2]。既往文獻報道和前期動物研究顯示，在肝移植、腎移植、器官IRI、病毒性感染、炎性反應等病理過程中，其表達迅速上調，是臟器損傷和炎癥的重要分子標志物[3-4]。據此推測TNC可能與移植肝早期損傷有密切聯系，但其在臨床肝移植術后早期患者血清中的水平變化規律仍未明確，其檢測價值也尚不明確。故本研究檢測了肝移植術后不同時間點的患者血清TNC水平，并進一步分析了血清TNC水平與移植肝損傷的關系，對這些問題進行了探討，旨在為早期移植肝損傷的預測提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2015年2月至2018年5月于空軍軍醫大學西京醫院肝膽外科接受肝移植治療的37例終末期肝病患者納入研究；男26例，女11例；平均年齡(46.76±10.03)歲，中位年齡51歲；主要病因：原發性肝細胞癌11例，乙型肝炎肝硬化22例，丙型肝炎肝硬化2例，酒精性肝硬化2例。所有患者均成功進行手術，無圍術期死亡，其余臨床資料見表1。依據美國國家癌癥研究所發布的2009年版肝功能不全分級標準[6]，按照術后第1天的相關生化指標水平將患者分為輕度肝損傷組(1～2級)17例和重度肝損傷組(3～4級)20例。所有納入研究者均對本研究知情同意并簽署知情同意書。本研究符合《赫爾辛基宣言》中的倫理準則，并由醫院倫理委員會審批通過。

表1 肝移植患者的部分臨床資料(n=37)

1.2方法

1.2.1血液標本的采集與保存 對所有納入研究者于術前及術后1、3、5、7 d，使用非抗凝管采集早晨空腹外周靜脈血4 mL，于室溫放置30 min后以4 000 r/min離心10 min，留取血清標本，在-80 ℃低溫冰箱中保存備用。

1.2.2血清TNC水平檢測 以酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測納入研究的患者在不同時間點的血清TNC水平。ELISA試劑盒購自英國Abcam公司。操作過程嚴格按照試劑盒說明書進行。最后，在490 nm波長下以酶標儀檢測各孔標準品的吸光度，繪制標準曲線后計算所測標本中的TNC水平。

1.4早期移植物功能評分(MEAF) 采用MEAF對患者術后的早期移植物損傷程度進行評估，評分的計算參照文獻[5]中的公式，計算所需的數據包括術后3 d內丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、國際標準化比值(INR)、膽紅素的最高值。

2 結 果

2.1兩組間血清TNC水平比較 術前兩組TNC水平較低，組間比較差異均無統計學意義(P>0.05)。術后兩組TNC水平均升高，且術后1～5 d的上升幅度較大，5～7 d的上升幅度較小，逐漸趨于穩定狀態。在各檢測時間點，重度肝損傷組的TNC水平高于輕度肝損傷組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組患者術后血清TNC 水平

2.3TNC水平用于預測移植肝損傷程度的ROC曲線分析 由于術后7 d兩組患者血清TNC上升幅度均明顯減小，逐漸趨于穩定狀態，故將術后7 d時的TNC水平作為預測移植肝損傷程度的指標進行ROC曲線分析。曲線下面積(AUC)為0.888(95%CI:0.781～0.995)，最佳臨界值為1 489 pg/mL，約登指數為0.715，此時的靈敏度、特異度分別為0.950、0.765。

2.4血清TNC水平與MEAF評分及住院時間的關系 血清TNC水平與MEAF評分呈正相關(r=0.33，P<0.05)，與患者住院時間呈正相關(r=0.38，P<0.05),見圖1、2。

圖1 患者血清TNC水平與MEAF評分的關系

圖2 患者血清TNC水平與住院時間的關系

3 討 論

盡管臨床肝移植已開展半個多世紀，但早期移植肝損傷和晚期慢性排斥始終是困擾肝移植近期和遠期療效的難題。相對于慢性排斥，移植肝損傷發生時間較早，影響也較為廣泛，若發現較晚或處理不當，則會導致移植肝功能不全、原發性移植肝無功能、急性腎損傷、腸道損傷和急性呼吸窘迫綜合征等多系統器官功能障礙的發生[7-9]，極大增加了肝移植患者圍術期并發癥發病率和病死率。肝損傷的早發現、早干預對提高肝移植患者生活質量及長期預后有重要意義。目前臨床常用于肝損傷評估的指標有ALT、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)等，但這些指標的靈敏度和對預后的預測價值都較為有限，還需要進一步尋找更加敏感的診斷指標。

本課題組在既往的研究中利用肝移植動物模型對移植肝早期損傷的發生機制進行了較為系統的研究。首先，將8例基因敲除小型豬作為供肝來源，對藏酋猴進行輔助性脾窩異位肝移植，通過對移植肝術前和術后的轉錄基因差異表達譜進行分析，發現術后TNC在移植肝組織內顯著上調。隨后，構建了同種異基因大鼠肝移植模型，發現移植后7 d，TNC在受體血清中的水平和移植肝組織內表達水平均比對照組有明顯升高。進一步的統計分析還表明TNC升高水平與Banff分級評估的排斥活動指數(RAI)呈正相關。這些結果初步證實TNC與肝移植術后早期移植肝損傷有一定聯系。

為進一步明確TNC在臨床肝移植術后患者體內水平的變化規律，探討其與移植肝損傷的關系及其檢測價值，課題組開展了本項研究。結果表明，TNC在肝移植術后患者體內水平明顯升高，與動物實驗結果是一致的。依據美國國家癌癥研究所發布的2009年版肝功能不全分級標準[6]，按照術后第1天的生化指標，將患者分為輕度肝損傷組和重度肝損傷組，比較兩組患者的檢測結果發現，在術后各檢測時間點，重度肝損傷組的TNC水平均明顯高于輕度肝損傷組，提示TNC的升高幅度反映了移植肝的損傷程度。ROC曲線分析顯示，TNC預測移植肝損傷的AUC為0.888，最佳臨界值為1489 pg/mL。TNC水平與MEAF評分、住院時間均呈正相關(r=0.33、0.38，P<0.05)。分析TNC水平與住院時間呈正相關關系的可能原因：術后重度肝損傷組患者的恢復時間較輕度肝損傷組患者長，而TNC水平恰恰反映的是肝損傷的嚴重程度，與術后移植肝及患者的恢復情況密切相關。術后TNC水平越高，提示肝損傷程度越重，其術后恢復時間可能較長，故住院時間延長。

作為細胞外基質中具有獨特六臂體結構的寡聚糖蛋白，TNC的生物學功能十分復雜，目前相關的體內研究資料較少，還不能完全判斷其表達規律及檢測價值。但已有的研究證據已提示TNC的表達與各種病因所致的肝損傷有一定的聯系。例如，BENBOW等[10]在一項針對HCV肝硬化患者的前瞻性研究中發現，TNC在患者血清中的水平顯著升高，其升高幅度與AST、終末期肝病模型(MELD)評分、Child-Pugh 評分均呈正相關關系；而TNC聯合AST可準確判斷HCV感染程度和肝損傷程度，其診斷特異度和靈敏度均優于其他指標。KURIYAMA等[11]在小鼠體內完全敲除TNC表達，然后建立肝臟IRI模型，發現TNC缺乏可減少白細胞在肝臟組織內的蓄積并抑制白細胞介素(IL)-1β、IL-6和趨化因子CXC配體2(CXCL2)的分泌，減輕肝臟的損傷程度并促進肝組織的修復和再生?？偟膩碚f，文獻[12-14]報道顯示TNC在正常肝組織中的表達量很低，但在損傷后的肝組織中表達量出現異常增高，是當前肝臟疾病治療研究中的重要靶標分子。

本研究初步證實TNC與術后早期移植肝損傷有關，對于明確移植肝損傷程度具有潛在的預測價值。但由于目前缺乏公認的體外研究肝移植機制的細胞模型，因此介導TNC在肝移植術后的表達變化的分子及細胞學機制仍有待進一步探討。此外，受限于肝移植術后肝組織標本獲取困難，未使用臨床肝移植術后標本進行TNC相關檢測，計劃在后續工作中予以完善。

綜上所述，TNC在術后早期肝移植患者體內水平異常升高，其反映了移植肝損傷的程度并可能在免疫損傷、IRI等過程中發揮重要作用，可為肝移植術后早期移植肝損傷的診斷和治療提供新的思路。