甘肅地區(qū)葉酸代謝相關(guān)酶MTHFR、MTRR基因多態(tài)性研究

包麗娥，申東生，楊 勇，張宏磊，郭曉曉

甘肅金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)暨病理診斷所,甘肅蘭州 730070

葉酸屬于B族維生素，是機(jī)體必需的營養(yǎng)物質(zhì)之一，人體無法合成，需經(jīng)過多種酶的催化才具有代謝活性[1]，亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)和甲硫氨酸合成酶還原酶(MTRR)是參與體內(nèi)葉酸代謝的關(guān)鍵酶。MTHFR主要功能是將5,10-亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)化為5-甲基四氫葉酸，5-甲基四氫葉酸是同型半胱氨酸再次甲基化為蛋氨酸的甲基供體[2-3]，MTHFR C677T、MTHFR A1298C位點(diǎn)突變使酶活性降低[4]，造成葉酸水平降低及高同型半胱氨酸血癥；若MTRR基因發(fā)生變異，就會(huì)引起血漿同型半胱氨酸水平升高M(jìn)TRR A66G位點(diǎn)GG基因型與AA基因型相比，酶活性降低了4倍[5]，一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)MTRR A66G位點(diǎn)多態(tài)性是高同型半胱氨酸水平的風(fēng)險(xiǎn)因素[6]。大量流行病學(xué)和臨床研究都證實(shí)高同型半胱氨酸水平是動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死、腦卒中及外周血管病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[7-8]。同時(shí)，慢性的細(xì)胞內(nèi)同型半胱氨酸水平升高可導(dǎo)致腺苷蛋氨酸與腺苷同型半胱氨酸的比值降低，使甲基轉(zhuǎn)移酶受抑制而出現(xiàn)低甲基化，可造成染色體不分離，與出生缺陷密切相關(guān)，如唐氏綜合征、唇腭裂、神經(jīng)管缺陷等新生兒缺陷[9-10]。本研究以甘肅地區(qū)育齡女性為研究對象，對受檢者M(jìn)THFR C677T、A1298C位點(diǎn)和MTRR A66G位點(diǎn)的基因型進(jìn)行了分析，旨在獲取育齡女性人群中MTHFR和MTRR的基因多態(tài)性特征，從而為當(dāng)?shù)刂朴喨~酸補(bǔ)充方案提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2018年9月至2019年9月甘肅各地區(qū)進(jìn)行葉酸代謝能力檢測的育齡女性納入研究，共4 935例，年齡16～45歲，民族不限。抽取納入研究者外周靜脈血2 mL于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中。送檢標(biāo)本若不能馬上檢測則置于4 ℃保存,并在1周內(nèi)完成檢測。

1.2方法

1.2.1多態(tài)性位點(diǎn)基因的檢測 使用MTHFR C677T、MTHFR A1298C和MTRR A66G基因檢測試劑盒(PCR-金磁微粒層析法,購自西安金磁納米生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行檢測，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。從人外周血細(xì)胞中提取基因組DNA，利用等位基因特異性聚合酶鏈反應(yīng)(AS-PCR)獲得MTHFR C677T、MTHFR A1298C和MTRR A66G位點(diǎn)突變或未突變的等位基因擴(kuò)增片段，使用的PCR儀器為ABI7500型。具體步驟：將20 μL蛋白酶K溶液加入2 mL離心管的管底，然后依次加入100 μL全血、200 μL裂解液，用渦旋振蕩器混合15 s，56 ℃水浴20 min；向樣品中依次加入300 μL結(jié)合液、25 μL的磁性微粒，渦旋混勻，室溫靜置5 min；磁性分離5 min，棄上清液；從磁性分離器上取出離心管，加入400 μL清洗液Ⅰ，渦旋混勻，磁性分離至上清液澄清，重復(fù)本步操作，以400 μL清洗液Ⅰ重復(fù)清洗1次；從磁性分離器上取出離心管，加入400 μL清洗液Ⅱ，渦旋混勻，磁性分離至上清澄清，棄上清液，將其室溫晾干；向管中加入100 μL洗脫液，渦旋混勻，56 ℃水浴5 min；將離心管置于磁性分離器上，將上清液(分離純化得到的DNA溶液)轉(zhuǎn)移到2 mL離心管中；將制備好的DNA溶液直接加入于已配制好的PCR反應(yīng)體系：突變(標(biāo)記為“M”)管和野生型(標(biāo)記為“WT”)管中，進(jìn)行PCR檢測。PCR程序設(shè)置如下：50 ℃ 2 min，95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，65 ℃ 1 min，共26個(gè)循環(huán)；65 ℃ 10 min，4 ℃保存。最后，取出PCR產(chǎn)物，于2～8 ℃放置。從密封袋中取出檢測卡，將待測樣本管中的PCR產(chǎn)物滴加在檢測卡對應(yīng)的樣品墊處，放置2～5 min，然后對結(jié)果進(jìn)行判讀。根據(jù)檢測線(T線)是否出現(xiàn)相應(yīng)條帶判讀各個(gè)位點(diǎn)的基因型，若M管產(chǎn)物在試紙條T線處不出現(xiàn)條帶而WT管產(chǎn)物出現(xiàn)條帶則為野生型，反之則為純合突變型，若兩管產(chǎn)物均在T線處出現(xiàn)條帶則為雜合突變型。

1.2.2觀察指標(biāo) 采用Hardy-Weinberg平衡分析MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G基因多態(tài)性是否符合遺傳平衡。計(jì)算葉酸代謝相關(guān)基因各多態(tài)性位點(diǎn)(MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G)的基因型頻率和等位基因頻率。將納入研究的4 935例育齡女性分成不同年齡段的人群，即<20歲、20～<25歲、25～<30歲、30～<35歲、≥35歲，比較各年齡段人群間上述基因多態(tài)性位點(diǎn)基因型分布。將納入研究的育齡女性按區(qū)域來源(酒泉、張掖地區(qū)，武威地區(qū)，定西、臨夏地區(qū)，甘南地區(qū)，隴南、天水地區(qū)和平?jīng)龅貐^(qū))分組進(jìn)行比較，觀察各區(qū)域來源人群間上述基因多態(tài)性位點(diǎn)基因型分布。將本研究的等位基因頻率與其他地區(qū)的相應(yīng)數(shù)據(jù)(均來自文獻(xiàn)[11])進(jìn)行比較。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1Hardy-Weinberg平衡分析 將納入研究人群的MTHFR C677T、A1298C位點(diǎn)和MTRR A66G位點(diǎn)的基因多態(tài)性分布進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)，均符合遺傳平衡(P>0.05)，見表1，表明樣本具有本區(qū)域群體代表性。

表1 葉酸代謝相關(guān)基因多態(tài)性位點(diǎn)的Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)(n)

2.2葉酸代謝相關(guān)基因的多態(tài)性分析 MTHFR C677T位點(diǎn)：CC、CT及TT基因型頻率分別為29.6%(1 461/4 935)、49.3%(2 435/4 935)、21.1%(1 039/4 935)；C等位基因頻率為54.3%，T等位基因頻率為45.7%。MTHFR A1298C位點(diǎn)：AA、AC及CC基因型頻率分別為68.9%(3 401/4 935)、28.1%(1 384/4 935)、3.0%(150/4 935)；A等位基因頻率為82.9%，C等位基因頻率為17.1%。MTRR A66G位點(diǎn)：AA、AG及GG基因型頻率分別為49.5%(2 444/4 935)、43.5%(2 147/4 935)、7.0%(344/4 935)，A等位基因頻率為71.3%，G等位基因頻率為28.7%。

2.3各年齡段間基因多態(tài)性位點(diǎn)基因型分布比較 甘肅地區(qū)各年齡段間育齡女性MTHFR C677T、A1298C，MTRR A66G位點(diǎn)的基因型分布比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.579、9.593、6.073，P>0.05),見表2～4。

表2 甘肅地區(qū)各年齡段間育齡女性MTHFR C677T位點(diǎn)基因多態(tài)性比較[n(%)]

表3 甘肅地區(qū)各年齡段間育齡女性MTHFR A1298C位點(diǎn)基因多態(tài)性比較[n(%)]

表4 甘肅地區(qū)各年齡段間育齡女性MTRR A66G位點(diǎn)基因多態(tài)性比較[n(%)]

2.4甘肅地區(qū)各區(qū)域間育齡女性基因多態(tài)性位點(diǎn)基因型分布比較 甘肅地區(qū)各區(qū)域間育齡女性MTHFR C677T、A1298C，MTRR A66G位點(diǎn)基因型分布比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=16.380、14.274、10.089，P>0.05),見表5～7。

表5 甘肅地區(qū)各區(qū)域間育齡女性MTHFR C677T位點(diǎn)基因多態(tài)性比較[n(%)]

表6 甘肅地區(qū)各區(qū)域間育齡女性MTHFR A1298C位點(diǎn)基因多態(tài)性比較[n(%)]

表7 甘肅地區(qū)各區(qū)域間育齡女性MTRR A66G位點(diǎn)基因多態(tài)性比較[n(%)]

2.5本研究與省外其他地區(qū)數(shù)據(jù)的比較 本研究中MTHFR、MTRR多態(tài)性位點(diǎn)等位基因頻率與長春、新疆、廊坊、銀川、淄博、鄭州、蘇州、湖北、眉山、湘潭、云南、南寧、陽江、海南等地區(qū)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；甘肅地區(qū)育齡女性MTHFR C677T位點(diǎn)等位基因頻率與長春、廊坊、淄博、鄭州、眉山、湖北、湘潭、云南、南寧、陽江、海南等地區(qū)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與新疆、銀川、蘇州等地區(qū)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。MTRR A1298C位點(diǎn)等位基因頻率與長春、廊坊、淄博、鄭州、湖北、湘潭、南寧、陽江、海南等地區(qū)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與新疆、銀川、蘇州、眉山、云南等地區(qū)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。MTRR A66G位點(diǎn)等位基因頻率與長春、廊坊、銀川、淄博、鄭州、眉山、湖北、湘潭、云南、南寧等地區(qū)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與新疆、蘇州、陽江、海南等地區(qū)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

葉酸在DNA合成、甲基化修飾及個(gè)體生長發(fā)育和基因表達(dá)調(diào)控等方面發(fā)揮著重要作用[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國出生缺陷總發(fā)生率約為5.6%，出生缺陷總發(fā)生率呈上升趨勢；出生缺陷不僅是造成兒童殘疾的重要原因，也日漸成為兒童死亡的主要原因[11]。有研究表明，葉酸代謝相關(guān)酶MTHFR和MTRR基因多態(tài)性與不良孕產(chǎn)結(jié)局有一定的關(guān)系[12]。MTHFR基因多態(tài)性突變位點(diǎn)已有近20種，其中最為重要的是C677T和A1298C這兩個(gè)位點(diǎn)[13]。MTRR基因最常見的一個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)是A66G，它會(huì)導(dǎo)致多肽鏈第22位的異亮氨酸被甲硫氨酸取代。體外研究表明，要想使甲硫氨酸合成酶達(dá)到最大反應(yīng)速度，A66G位點(diǎn)變異型相較于野生型酶反應(yīng)體系中使用MTRR與甲硫氨酸合成酶的比例要高3～4倍，意味著該位點(diǎn)對MTRR的活性影響非常之大[14]。

本研究顯示，甘肅地區(qū)MTHFR C677T位點(diǎn)突變率較高，CC基因型頻率為29.6%，而雜合突變基因型頻率較高，為49.3%；MTHFR A1298C位點(diǎn)突變率較低，AA基因型頻率為68.9%，其純合突變基因型頻率僅為3.0%；MTRR A66G突變率較高，AA基因型頻率為49.5%，雜合突變基因型頻率較高，為43.5%，純合突變基因型頻率為7.0%。甘肅地區(qū)育齡女性各年齡段間上述基因多態(tài)性位點(diǎn)基因型構(gòu)成比分布比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；甘肅地區(qū)育齡女性各區(qū)域間上述基因多態(tài)性位點(diǎn)基因型構(gòu)成比分布比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。有研究發(fā)現(xiàn)，中國漢族人群C677T的突變頻率為40%,MTHFR C677T等位基因頻率呈現(xiàn)地理梯度性變化，突變頻率隨著緯度的增加先增加再減少；TT基因型頻率在南方地區(qū)為6.6%,中部地區(qū)為14.2%,北部地區(qū)為21.3%,最北部地區(qū)為15.0%[15]。甘肅地區(qū)育齡女性的上述基因多態(tài)性位點(diǎn)的基因型構(gòu)成比分布與年齡及省內(nèi)地理位置無關(guān)，可能是因?yàn)橥幱谖覈鞅钡貐^(qū)；而上述基因多態(tài)性位點(diǎn)的基因型頻率與國內(nèi)非西北地區(qū)的部分地區(qū)間存在地域性差異。

葉酸是一種能夠預(yù)防神經(jīng)管畸形的保護(hù)劑[16]，補(bǔ)充葉酸可以將神經(jīng)管畸形的發(fā)病率降低70%[17]。葉酸補(bǔ)充是我國目前針對新生兒神經(jīng)管畸形的主要預(yù)防措施之一。孕婦體內(nèi)葉酸水平受飲食習(xí)慣、地域、遺傳等因素的影響，對營養(yǎng)的需求因人而異，對備孕及已懷孕的女性進(jìn)行葉酸利用能力的評估，有助于了解機(jī)體對葉酸的利用能力，從而制訂個(gè)性化的營養(yǎng)干預(yù)方案。