采用稀釋法評(píng)價(jià)狼瘡抗凝物對(duì)凝血因子活性檢測(cè)的干擾

顏 楠，韓 峰，刁艷君，陳啟穎，劉家云

空軍軍醫(yī)大學(xué)附屬西京醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西西安 710032

狼瘡抗凝物(LAC)是一種磷脂依賴的病理性循環(huán)抗凝物質(zhì),是抗磷脂抗體(APL)的一種[1]，為IgG或IgM的異質(zhì)性免疫球蛋白。主要通過結(jié)合β2糖蛋白Ⅰ、人凝血酶原及其他磷脂復(fù)合物來干擾磷脂依賴的凝血過程,使體外檢測(cè)的凝血時(shí)間延長(zhǎng)[2]。持續(xù)LAC陽(yáng)性的患者被認(rèn)為有較高的血栓形成和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn),與不明原因習(xí)慣性流產(chǎn)、死胎、血栓性疾病及某些自身免疫性疾病密切相關(guān)[3]。因LAC的異質(zhì)性，檢測(cè)試劑種類、磷脂構(gòu)成和濃度、檢測(cè)原理(有磁珠法與光學(xué)法、散射光與透射光)的不同，以及檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)判斷方式的不同等均會(huì)影響到檢測(cè)結(jié)果[4]。有部分LAC陽(yáng)性的患者有凝血酶原時(shí)間(PT)和活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)的延長(zhǎng)，會(huì)使凝血因子活性的檢測(cè)出現(xiàn)假性降低的結(jié)果。稀釋法是指將原血漿標(biāo)本按不同稀釋比例進(jìn)行稀釋。由于凝血因子的促凝過程是一系列酶促反應(yīng)，其反應(yīng)速度與強(qiáng)度在一定范圍內(nèi)與凝血因子的活性呈線性相關(guān)[5]，故稀釋后各濃度血漿的凝血因子活性通過乘以稀釋倍數(shù)，可校正為與檢測(cè)結(jié)果相同或相近的結(jié)果[6]。若存在病理性的抗凝物質(zhì)，如LAC，稀釋法可以通過降低干擾物質(zhì)的滴度，使檢測(cè)結(jié)果能更準(zhǔn)確地反映體內(nèi)凝血因子的真實(shí)水平。

1 資料與方法

1.1一般資料 在2020年10月至2021年4月于本院住院治療的抗磷脂綜合征(APS)患者中選取LAC陽(yáng)性[LAC檢測(cè)采用改良的稀釋蝰蛇毒時(shí)間試驗(yàn)(dRVVT)進(jìn)行篩選和確診試驗(yàn)，計(jì)算LA比值(LA比值=篩選試驗(yàn)比值/確診試驗(yàn)比值)，LA比值>1.2為陽(yáng)性]且PT、APTT均延長(zhǎng)的6例患者作為L(zhǎng)AC陽(yáng)性組，男1例、女5例，年齡14～49歲、平均26.33歲。另外，選取同期于本院體檢的健康者30例作為對(duì)照組，男、女各15例，排除有先天性凝血功能障礙、凝血因子缺乏、肝臟疾病、嚴(yán)重感染、血栓栓塞性疾病者，年齡23～56歲，平均36.00歲。

1.2儀器與試劑 使用的檢測(cè)儀器為Sysmex公司生產(chǎn)的Sysmex CS5100型全自動(dòng)凝血分析儀。PT、APTT、凝血因子活性、LAC檢測(cè)試劑或試劑盒及質(zhì)控品均為德國(guó)西門子公司產(chǎn)品。

1.3方法 采集受試者清晨空腹靜脈血于枸櫞酸鈉抗凝管中，以1 500×g離心15 min后分離血漿。采用全自動(dòng)凝血分析儀及相應(yīng)的配套試劑進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)照組：將30例受試者的混合血漿分別按1∶1、1∶21、1∶22、1∶23、1∶24、1∶256種不同稀釋倍數(shù)配制成不同濃度的血漿，稀釋液選用德國(guó)西門子公司生產(chǎn)的原裝OVB緩沖液。分別檢測(cè)凝血因子FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ、FⅡ、FⅤ、FⅦ、FⅩ活性，將其與所對(duì)應(yīng)稀釋度的理論值作線性相關(guān)分析。LAC陽(yáng)性組：用同樣的方法采集6例LAC陽(yáng)性組患者標(biāo)本，將6例患者的標(biāo)本分別按同樣的方法進(jìn)行梯度稀釋并對(duì)上述8種凝血因子的活性進(jìn)行檢測(cè)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05；應(yīng)用GraphPad Prism 8軟件繪圖。

2 結(jié) 果

2.1對(duì)照組凝血因子活性檢測(cè)值與理論值的相關(guān)性分析 對(duì)照組8種凝血因子活性檢測(cè)值與理論值均呈直線相關(guān)(R2≥0.90，P<0.05)，見圖1。凝血因子活性在不存在任何干擾物質(zhì)的情況下隨稀釋度的增加而逐漸降低。

圖1 對(duì)照組凝血因子活性檢測(cè)值與理論值的線性相關(guān)分析

2.2LAC陽(yáng)性組凝血因子活性檢測(cè) 隨著稀釋倍數(shù)的增加，內(nèi)源性凝血因子(FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ)活性隨之升高，能恢復(fù)到大致正常水平，且升高到一定水平時(shí)不再隨著稀釋倍數(shù)的增加而繼續(xù)升高。此處列舉LAC比值最高患者的檢測(cè)結(jié)果，見表2。

表2 LAC比值最高患者的8種凝血因子不同稀釋倍數(shù)的檢測(cè)結(jié)果(%)

3 討 論

APTT檢測(cè)是一項(xiàng)針對(duì)內(nèi)源性凝血途徑的篩查試驗(yàn),參與內(nèi)源性凝血的因子主要有FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ。APTT的檢測(cè)方法為凝固法。當(dāng)APTT延長(zhǎng)時(shí)通常提示內(nèi)源性凝血功能障礙[7]，與血液不凝和出血有關(guān)。LAC陽(yáng)性患者體內(nèi)的LAC可直接與凝血酶原上的抗原決定簇結(jié)合，抗原抗體復(fù)合物與陰離子磷脂相結(jié)合，抑制凝血酶原、FⅧ、FⅨ、FⅩ等與磷脂微粒的結(jié)合，也可導(dǎo)致APTT延長(zhǎng)[8]。內(nèi)源性凝血因子的檢測(cè)方法同樣為凝固法[9]，其原理是通過把不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)血漿檢測(cè)得到的APTT值繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線來讀取凝血因子活性水平，可以分別測(cè)得內(nèi)源性凝血因子FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ的活性。dRVVT的原理是在待測(cè)血漿中加入激活劑蝰蛇毒和鈣離子，魯賽爾氏蝰蛇毒可直接活化凝血因子X使血液凝固[3]。其包括篩選試驗(yàn)和確證試驗(yàn)。如果血漿中存在LAC能使篩選試驗(yàn)的凝固時(shí)間延長(zhǎng)。確診試驗(yàn)的試劑和篩選試驗(yàn)試劑一樣，但其含高濃度磷脂，外源性磷脂與LA抗體結(jié)合，很大程度上糾正了凝固時(shí)間。計(jì)算其比值(LA比值=篩選試驗(yàn)比值/確診試驗(yàn)比值)，若LA比值>1.2，則判斷患者為L(zhǎng)AC陽(yáng)性[10]。該試驗(yàn)證明LAC存在特異且簡(jiǎn)便的檢測(cè)手段。國(guó)際血栓與止血學(xué)會(huì)(ISTH)與臨床實(shí)驗(yàn)室和標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)分別在2009年與2014年更新了關(guān)于LAC檢測(cè)相關(guān)指南文件[11-12],指南均推薦將dRVVT和APTT兩種試驗(yàn)作為L(zhǎng)AC的一線篩查試驗(yàn)。

當(dāng)LAC陽(yáng)性患者表現(xiàn)出APTT假性延長(zhǎng)時(shí)，需要通過APTT來反映的內(nèi)源性凝血因子FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ活性檢測(cè)也同樣會(huì)受到干擾。這無疑將大大增加臨床的診療難度。臨床應(yīng)分析患者是否存在可導(dǎo)致LAC陽(yáng)性的感染或藥物的使用，進(jìn)一步檢測(cè)并排除自身免疫性疾病。LAC陽(yáng)性的自身免疫性疾病以系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)[13]和APS多見，其中LAC陽(yáng)性是APS的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一[14]。當(dāng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)間隔12周以上，連續(xù)2次檢測(cè)LAC為陽(yáng)性時(shí)，加上一項(xiàng)血栓形成或復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的臨床表現(xiàn)即可診斷APS。LAC陽(yáng)性患者被認(rèn)為有較高的血栓風(fēng)險(xiǎn)[15]，但極少有LAC陽(yáng)性患者發(fā)生出血[16]。

本研究首先將健康人混合血漿標(biāo)本各稀釋度的凝血因子活性檢測(cè)結(jié)果與其對(duì)應(yīng)稀釋度的理論活性值進(jìn)行線性相關(guān)分析，8種凝血因子活性檢測(cè)值與理論值均呈直線相關(guān)(R2≥0.90，P<0.05)，而且凝血因子活性在不存在任何干擾物質(zhì)的情況下隨稀釋度的增加而逐漸降低，即只表現(xiàn)為單純的稀釋效應(yīng)。另外，本研究收集了6例LAC陽(yáng)性且PT、APTT均延長(zhǎng)的患者標(biāo)本，用稀釋法進(jìn)行了同樣的凝血因子活性檢測(cè)。結(jié)果顯示隨著稀釋度的增加，凝血因子FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ活性并沒有表現(xiàn)出稀釋效應(yīng)，而是隨稀釋比例增加而逐漸升高最終恢復(fù)至大概正常水平，即明確提示存在干擾。因其標(biāo)本在稀釋的過程中LAC的滴度也隨之降低，最終可以得到相對(duì)準(zhǔn)確的結(jié)果。對(duì)于內(nèi)源性凝血因子活性降低且LAC升高的患者，應(yīng)綜合分析實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)結(jié)果，并需要進(jìn)一步采用稀釋法對(duì)凝血因子活性進(jìn)行檢測(cè)。而FⅡ、FⅤ、FⅦ、FⅩ的活性變化較小是由于這4個(gè)凝血因子主要反映外源性凝血途徑的凝血狀況，而LAC主要作用于凝血酶原復(fù)合物(因子Ⅹa、Ⅴa、Ca2+及磷脂)以及Tenase復(fù)合物(因子Ⅸa、Ⅷa、Ca2+及磷脂)，并能在體外延長(zhǎng)磷脂依賴的凝血試驗(yàn)的時(shí)間[17]。所以內(nèi)源性凝血途徑的篩查試驗(yàn)APTT對(duì)LAC較敏感，通過APTT檢測(cè)得到的FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ活性也更易受到干擾。在明確APTT延長(zhǎng)的原因是LAC且不存在其他出血風(fēng)險(xiǎn)因素時(shí),不應(yīng)將APTT延長(zhǎng)與內(nèi)源性凝血因子活性降低視為手術(shù)禁忌。

臨床實(shí)驗(yàn)室有必要開展凝血因子活性、LAC等特殊項(xiàng)目的檢測(cè)，以協(xié)助復(fù)雜出血性疾病與血栓性疾病的診斷。最后，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)與臨床科室密切溝通，使臨床科室充分了解影響實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果的干擾因素以及各類疾病的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)路徑，避免錯(cuò)誤理解和使用檢驗(yàn)結(jié)果，從而共同為患者提供更加快速、準(zhǔn)確的診斷與治療。