脊髓背角神經元STAT3/SDF-1 信號通路在大鼠術后慢性疼痛形成中的作用

孫揚 張瓔 張海良 李靜 孫文艷

西安醫學院第二附屬醫院1康復醫學科，2醫務處，3院辦，4耳鼻喉科（西安 710038）

隨著人類平均壽命逐年增加，惡性腫瘤、器官移植、復雜創傷等需要進行手術治療的疾病發病率呈逐年上升趨勢。由于該類手術耗時較長，術中固定牽拉較久，慢性術后疼痛綜合征（chronic postsurgical pain syndromes，CPSP）發生率非常高，主要臨床癥狀為操作部位及與其相鄰組織持續數月甚至數年的痛覺過敏或出現不同程度觸誘發痛情況［1-2］，當前治療挑戰極大，相關的病理生理機制仍有待明確。皮膚肌肉切口牽拉術（skin/muscle incision and retraction，SMIR）可導致成年大鼠術后3～22 d 機械痛閾顯著下調，是一種術后急慢性疼痛轉化常用動物模型［3］，可有助于揭示CPSP 的深層病理生理機制。

趨化因子家族成員基質細胞衍生因子1（stromal cell-derived factor 1，SDF-1）可介導多種因中樞神經損傷、炎癥等導致的痛覺過敏的產生［4-5］。筆者前期研究發現，SMIR 手術可能通過上調脊髓背角SDF-1 的表達誘導中樞敏感化及痛覺過敏，提示脊髓背角SDF-1 上調可能具有潛在的干預價值［6］。然而，術后脊髓背角SDF-1 的上調機制尚不明確。近期研究顯示信號轉導和轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）參與介導SMIR 術后CX3CL1 上調和痛覺過敏［7］。以往研究表明，抑制STAT3 可以下調編碼趨化因子如CCL2 和CXCL5 的mRNA 的表達，提示STAT3 調節趨化因子的轉錄［8］。基于此，筆者推測脊髓背角STAT3 與SDF-1 可能在術后急慢性疼痛轉化過程中具有重要作用。本研究擬通過SMIR 大鼠模型明確脊髓背角STAT3 參與SDF-1 上調和疼痛過敏的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 動物來源選用體質量為220～240 g 的雄性SD 大鼠飼養于規范標準環境中。所有實驗程序均已獲得第二軍醫大學動物護理和使用委員會的批準（SMMU，許可證號：2011023），全部實驗步驟均按照實驗動物護理與應用指南實施。

1.2 方法

1.2.1 分組將SD 大鼠分為sham（假手術）組、SMIR 組、SMIR+anti-SDFI 組和SMIR+S3I-201 組，每組12 只大鼠。

1.2.2 SMIR 模型構建按規范建立大鼠皮膚肌肉切口牽拉術持續性疼痛模型［9］。sham（假手術）組除了不牽拉神經，其余操作與SMIR 組相同。

1.2.3 鞘內置管及給藥方法如先前所述進行鞘內注射［10］。在4%水合氯醛（0.4 g/kg，腹腔麻醉）下行椎板切除術。然后將聚乙烯10（PE-10）導管通過L4/L5 椎間隙植入蛛網膜下腔中，并將導管尖端置于腰膨大處。進行SMIR手術之前，允許大鼠至少恢復7 d。SMIR+anti-SDFI 組和SMIR+S3I-201 組大鼠在SMIR 手術前30 min 分別在鞘內給予SDF-1 中和性抗體（50 μg/10 μL，Torrey Pines Biolabs）和STAT3抑制劑S3I-201（100 μg/10 μL，Selleckchem），此后連續給藥10 d。

1.2.4 痛行為學監測用up-down 法監測大鼠撤足反射閾值有無變化，觀測大鼠痛閾改變情況與持續時間。用Von Frey hair（0.8、1.12、1.68、3.2、4.89、6.3、8.6、12.6 和20.2 g）刺激大鼠后爪底部皮膚。計算50%陽性反應閾值為大鼠的撤足反射閾值PWT［11］。前期實驗提示，通常SMIR 后第10 天時測得大鼠痛閾最低，并能持續至第20 天，故該實驗所確定取樣時間為術前1 d 及術后第1、5、10、20 天。

1.2.5 蛋白免疫印跡SMIR手術后第1、5、10、20天取大鼠脊髓，Western blot 方法檢測SDF-1 蛋白水平、磷酸化STAT3 水平及總蛋白水平。脊髓局部應用SDF-1 中和性抗體及STAT3 抑制劑S31-201，觀察SDF-1 蛋白水平。操作如下：取脊髓背角組織，添加Tris 裂解緩沖液低溫下勻漿、破碎并低溫離心，取上清。BCA 法檢測蛋白質濃度。進行SDS-PAGE 后轉移至PVDF 膜后TBST 封閉液室溫下封閉1 h。4 ℃過夜孵育SDF-1 一抗（稀釋比例為1∶1 000）、STAT3（稀釋比例為1∶1 000）、磷酸化STAT3（稀釋比例為1∶1 500），第2 天用TBST 洗膜3 次，共30 min。用辣根過氧化物酶標記的二抗孵育1 h，洗3次后進行ECL顯色，暗室曝光拍照。

1.2.6 免疫組化免疫組化方法檢測SDF-1、STAT3表達的細胞類型。戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉大鼠，并在升主動脈中灌注生理鹽水，然后在4 ℃下于0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.2～7.4）中加入4%多聚甲醛。取出L3/4 脊髓，在相同的固定劑中固定1 h 后轉移到30%的蔗糖中2 d。在低溫恒溫器（Leica CM1900）中切開脊髓切片（25 μm），并使用SDF-1（1∶300，Abcam）、磷酸化STAT3（Tyr705）（1∶100，Abcam）、NeuN（1∶500，Chemicon）、GFAP（1∶800，Chemicon）、Iba1（1∶200，Abcam）或OX-42（1∶250，Chemicon）的一抗進行免疫組化。4 ℃孵育過夜后，將切片與Cy3 偶聯和Alexa 488 偶聯的二抗在黑暗中于室溫孵育1 h。然后立即檢查熒光染色的切片，并使用熒光顯微鏡及共焦顯微鏡觀察。

1.2.7 染色質免疫共沉淀（ChIP）測定SMIR 手術后第1、5、10、20 和30 天取大鼠脊髓，染色質免疫共沉淀（ChIP）檢測STAT3 與SDF-1 啟動子相互作用。使用ChIP 分析試劑盒（Thermo）進行分析。快速取出L3/4 脊髓背角并置于1%甲醛中2 min。通過超聲處理將DNA 片段化，并用微球菌核酸酶消化。加入ChIP 稀釋緩沖液后，將100 μL 樣品保存為輸入。然后將STAT3 抗體（R＆D 系統）8 μL添加到500 μL 預先清除的染色質溶液中，并將樣品接種過夜。進行“IgG”（Sigma）免疫沉淀作為陰性對照。然后捕獲、洗脫和反向交聯抗體/DNA 復合物。從復合物和輸入級分中純化DNA，沉淀并重懸于60 μL 無核酸酶的水中，用于PCR。計算ChIP/輸入比。引物5′-AGAAAGGCAATGGGAGTGTGTG-3′和5′-CTCAGTCCTGCCGATAGACC-3′被設計為擴增SDF-1 啟動子片段（-1181/-879），該片段包含預測的STAT3 結合位點（-1085/-1075）。

1.3 統計學方法使用SPSS 13.0統計學軟件進行分析。對于行為學分析，使用雙向或單向ANOVA，并進行重復檢驗，隨后進行了Tukey 事后檢驗。對于qPCR、蛋白印跡和免疫組化數據，使用了雙向ANOVA，然后進行了Tukey 事后檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 脊髓背角SDF-1的上調導致SMIR后痛覺過敏通過檢測觀測時間段大鼠撤足反射閾值，相較對照組，皮膚肌肉切口牽拉術組大鼠實驗反射閾值顯著降低（P＜0.05），將中和SDF-1抗體注射于大鼠鞘內可升高SMIR導致的大鼠疼痛閾值（圖1A）。SMIR后第5、10、20天大鼠脊髓背角SDF-1的mRNA（圖1B）及蛋白（圖1C）表達水平均顯著上調（均P＜0.01）。

圖1 SMIR 后不同時間大鼠痛閾及脊髓SDF-1 的表達Fig.1 Paw withdrawal threshold and expression of SDF-1 in spinal cord at different phases after SMIR

2.2 脊髓背角STAT3 在SMIR 術后慢性疼痛中的作用Western blot 結果顯示（圖2A），SMIR 手術后第5～20 天，大鼠脊髓背角p-STAT3 與總STAT3 蛋白的比值顯著增加（P＜0.01）；且鞘內注射STAT3抑制劑S3I-201 可緩解SMIR 引起的大鼠痛閾的降低（P＜0.05，圖2B）。提示脊髓背角磷酸化的STAT3 參與SMIR 誘導的痛覺過敏。

圖2 脊髓背角STAT3 在SMIR 誘發的機械性痛覺過敏中的作用Fig.2 The role of spinal dorsal horn STAT3 in SMIR-induced mechanical hyperalgesia

2.3 SMIR 手術后脊髓背角神經中SDF-1 與p-STAT3 表達定位雙重免疫熒光染色結果表明，SDF-1 與Neun 陽性神經元共染，與GFAP 陽性星形膠質細胞不共染（圖3A）；p-STAT3 也與Neun 陽性神經元共染，與GFAP 陽性星形膠質細胞不共染（圖3B）。表明脊髓背角SDF-1 與p-STAT3 主要在Neun 陽性神經元中表達，而在GFAP 陽性星形膠質細胞中不表達，并且p-STAT3 可能調節SDF-1 的表達。

圖3 SMIR 手術后脊髓神經中SDF-1 與p-STAT3 表達定位Fig.3 Expression and localization of SDF-1 and p-STAT3 in spinal nerves after SMIR

2.4 SMIR 促進脊髓背角STAT3 與SDF-1 基因啟動子的結合Western blot 結果顯示（圖4A），鞘內注射STAT3 抑制劑S3I-201 顯著抑制了SMIR 術后脊髓背角SDF-1蛋白的表達（P＜0.01），表明脊髓背角STAT3 的激活可能介導了SMIR 誘導的SDF-1 的上調。與觀察到的脊髓背角SDF-1蛋白表達變化一致，定量PCR結果顯示（圖4B），S3I-201同樣抑制了SMIR 誘導的SDF-1 的mRNA 表達（P＜0.01），表明脊髓背角STAT3對SDF-1的調控發生在轉錄水平。Jaspar 數據庫預測STAT3 可能與SDF-1 基因啟動子區域-1085/-1075 區域發生結合，針對該區域所在的啟動子（-1181/-879）設計引物。ChIP-PCR 顯示（圖4C），與假手術相比，SMIR 后第10 天STAT3與SDF-1 基因啟動子的結合顯著增加（P＜0.01），提示脊髓背角STAT3 向SDF-1 基因啟動子的募集可能會進一步上調脊髓背角SDF-1 的表達并導致痛覺過敏。

圖4 脊髓背角STAT3 介導SMIR 術后SDF-1 的表達Fig.4 Spinal dorsal horn STAT3 mediates the expression of SDF-1 after SMIR

3 討論

CPSP發生率非常高，截至目前相關產生原因尚不明確，而常規使用各類鎮痛藥物效果不明顯［12］。明確手術導致痛覺過敏的機制，并進一步探索治療模式，可有效減輕患者痛苦從而降低社會醫療支出具有顯著醫學價值與現實意義。FLATTERS等［9］首先成功構建皮膚肌肉切口牽拉動物模型，該模型在保有外周神經正常功能前提下，效仿外科手術進行切口牽拉，并可引起1 個月左右持續性痛覺過敏，該模型的成功建立成為目前研究術后慢性疼痛的主要方法，因此被廣泛采用作為研究術后慢性痛機制的理想模型。

SDF-1 作為趨化因子家族中的重要成員，廣泛存在于中樞神經系統中，介導多種原因導致的痛覺過敏。報道顯示脊髓損傷、蜂毒注射模型誘導痛覺過敏中均檢測到SDF-1 的明顯上調［13-14］，SDF-1 還通過與其受體CXCR4 相結合介導神經損傷或嗎啡耐受誘導的痛覺過敏［15］。本研究證實：SMIR 手術顯著上調脊髓背角SDF-1 蛋白及mRNA 的表達，且鞘內注射SDF-1 中和性抗體顯著抑制SMIR 手術誘導的機械性痛覺過敏，提示SMIR 手術可能通過上調脊髓背角SDF-1 的表達誘導中樞敏感化及痛覺過敏，然而脊髓背角SDF-1 的上調機制目前仍不明確。STAT3 是在中樞神經系統中表達的重要轉錄因子，目前認為STAT3 不僅可以介導免疫和炎癥反應，而且在慢性疼痛中也起著至關重要的作用［16］。既往研究顯示，神經損傷會增加STAT3的磷酸化，抑制STAT3 通路會減弱機械性痛覺過敏［17-19］。本研究發現，SMIR 手術后大鼠脊髓背角神經元中的STAT3 明顯活化，p-STAT3 與總STAT3蛋白的比值顯著增加，且鞘內注射STAT3 抑制劑S3I-201 顯著減輕了SMIR 引起的疼痛，提示磷酸化的STAT3 可能參與SMIR 誘導的痛覺過敏。然而，STAT3 的激活是否會上調脊髓背角SDF-1 的表達尚不清楚。

為了進一步研究脊髓背角SDF-1 和STAT3 之間的潛在關系，首先要表明它們是否在很大程度上共定位，以及STAT3 抑制劑是否可以降低SMIR誘導的SDF-1 的上調。研究證明，STAT3 可以轉錄調節趨化因子CX3CL1、CXCL5、CXCL10 和CCL20的表達［8］。作為轉錄因子，當受到炎癥、損傷或其他情況的刺激時，STAT3 可以被激活，結合至其靶基因的啟動子區域并促進其轉錄［20］。本研究通過免疫熒光染色發現，脊髓背角SDF-1 與p-STAT3 主要在Neun 陽性神經元中表達，而在GFAP 陽性星形膠質細胞中不表達，說明神經元細胞而非小膠質細胞參與了術后痛覺反應，并且p-STAT3 可能通過調節SDF-1 的表達誘發術后慢性疼痛。相關研究發現，STAT3 激活后進入細胞核并與目的基因的啟動子相結合，通過調控目的基因的轉錄，在多種生物學功能中發揮作用［16］。ChIP 分析也證實，SMIR 增強了脊髓背角STAT3 向SDF-1 基因啟動子的募集，鞘內注射STAT3 抑制劑S3I-201 可顯著抑制SMIR 手術后SDF-1 蛋白和mRNA 水平的上調。這表明脊髓背角STAT3 對SDF-1 的調控發生在轉錄水平，S3I-201 可能通過抑制STAT3 磷酸化、STAT3 轉運到細胞核以及脊髓背角STAT3 與SDF-1 基因啟動子的結合來降低SDF-1 的表達。因此，SMIR 可能通過增強脊髓背角STAT3 向SDF-1 基因啟動子的募集，上調SDF-1 的表達，從而促進了機械性痛覺過敏的發生發展。

本研究首次提出了脊髓背角病理性上調的SDF-1 參與了SMIR 模型大鼠術后慢性疼痛的發生、發展，并且提出其上調機制可能是由轉錄因子STAT3 與SDF-1 啟動子結合增多、促進SDF-1 轉錄產生的。但本文也有一定的局限性：（1）沒有證明STAT3 與SDF-1 啟動子結合增多的原因，是否是由于SMIR 術后SDF-1 啟動子區域乙酰化水平增高或是其他原因；（2）沒有對STAT3 與SDF-1 可能的結合區域進行突變，之后觀察STAT3 還能否與突變后的SDF-1 啟動子區域結合以及其對SDF-1 表達的影響；（3）激活的STAT3 是否存在其他下游靶蛋白在本文中并未探究。

綜上所述，SMIR 手術可能通過激活脊髓背角STAT3，促進其與SDF-1 基因啟動子的結合，上調脊髓背角SDF-1 的表達，增強脊髓背角突觸傳遞效率，從而導致機械性痛覺過敏。這一結論為術后慢性疼痛提供了潛在的分子診斷依據和臨床治療靶點。而術后慢性疼痛是否還存在其他可能機制及STAT3/SDF-1 信號通路的具體調控方式，需要進一步深入研究。