利拉魯肽聯合鋅alpha2 糖蛋白對棕櫚酸誘導的HepG2 細胞凋亡、脂質代謝和炎癥因子表達的影響

范明娟 聶玉強 詹琪 李潔

廣州市第一人民醫院老年病科（廣州 510180）

非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）是世界范圍內最常見的慢性肝病，與血脂異常密切相關［1-2］。然而目前仍缺乏有效的NAFLD 防治策略。鋅alpha2糖蛋白（ZAG）是一種新型脂肪細胞因子，參與脂質分解、脂肪酸氧化等過程［3］。ZAG 通過調節相關基因表達顯著改善NAFLD 小鼠肝臟脂肪變及炎癥反應［4］。利拉魯肽是臨床糖尿病合并肥胖患者治療常用藥［5］。利拉魯肽通過抑制細胞凋亡對棕櫚酸誘導的肝細胞HepG2 損傷具有保護作用［6］。本研究以棕櫚酸誘導的人肝癌細胞（HepG2）建立肝脂毒性損傷模型，初步探討利拉魯肽聯合ZAG 對棕櫚酸誘導的HepG2 細胞凋亡、脂質代謝和炎癥因子表達的影響，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 組織來源選擇2017 年2 月至2018 年6 月于我院就診的40 例NALFD 患者肝組織（穿刺活檢標本）。其中男31 例，女9 例，平均年齡（45.7 ±8.3）歲。選擇年齡、性別相匹配的無肝臟疾病的40 例志愿者肝組織作為正常對照。NALFD 患者符合《非酒精性脂肪性肝病診療指南（2010 年修訂版）》診斷標準，且排除可導致脂肪肝的其他特定疾病和2 周內服用過利尿劑、皮質激素等影響糖代謝、脂代謝以及服用過保肝藥物患者。本研究的開展獲得我院倫理委員會批準，所有研究對象均知情同意。

1.2 實驗材料人肝癌細胞系HepG2 購自中國科學院上海細胞庫；利拉魯肽（純度99%）、棕櫚酸（純度99%）購自上海源葉生物科技公司；穩定敲減ZAG 的質粒（ZAG shRNA）及其對照（NC shRNA）、ZAG 過表達質粒（pcDNA-ZAG）及其對照（pcDNA）購自上海生工公司；總RNA 提取試劑盒購于北京普洛麥格生物；HiScript 逆轉錄酶試劑盒、SYBR qPCR Master Mix 試劑盒購于南京諾唯贊生物公司；甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）含量測定試劑盒、白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯吸附測定（ELISA）試劑盒購于北京索萊寶生物公司；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）細胞凋亡檢測試劑盒購于上海貝博生物公司；顯微分光光度計（型號K5500）購自北京凱奧科技公司；熒光定量PCR儀（7500 型）購于美國ABI 公司；流式細胞儀（Gallios 型）購于美國貝克曼公司；酶標儀（ELX800 型）購自美國Bio-Tek 公司。

1.3 細胞培養、轉染和分組采用含10%胎牛血清的DMEM 培養基在含5% CO2、37 ℃的培養箱中復蘇HepG2 細胞，當細胞90%匯合時加入胰蛋白酶消化，按照1∶3 比例轉移至新的培養瓶培養。將對數期HepG2 細胞按照2×105個/孔密度鋪6 孔板，利用脂質體Lipofectamine 2000 將ZAG shRNA、NC shRNA、pcDNA-ZAG、pcDNA 分別轉染60%匯合的細胞，收獲轉染48 h 細胞按照實時定量PCR（RT-qPCR）和蛋白質印跡法分析轉染效果，隨后進行下一步實驗。未處理的HepG2 細胞記為對照（Con）組；用含0.4 mmol/L 棕櫚酸的培養液孵育細胞24 h［5］記為棕櫚酸組；用含0.4 mmol/L 棕櫚酸、100 nmol/L 利拉魯肽培養液孵育細胞24 h［5］記為棕櫚酸+利拉魯肽組；用含0.4 mmol/L 棕櫚酸的培養液孵育轉染pcDNA-ZAG 細胞24 h 記為棕櫚酸+pcDNA-ZAG 組；采用含0.4 mmol/L 棕櫚酸、100 nmol/L 利拉魯肽培養液分別孵育轉染ZAG shRNA、pcDNA-ZAG 細胞24 h 記為棕櫚酸+利拉魯肽+ZAG shRNA 組、棕櫚酸+利拉魯肽+pcDNAZAG 組。

1.4 RT-qPCR 檢測ZAG mRNA 表達總RNA 提取試劑盒從HepG2 細胞提取總RNA，并采用K5500顯微分光光度計進行定量；利用HiScript 逆轉錄酶試劑盒將500 ng RNA 反轉錄為cDNA，根據SYBR qPCR Master Mix 試劑盒說明書進行RT-qPCR。利用β-actin 作為內部參照，2-ΔΔCt法確定ZAG mRNA表達量。β-actin 引物上游5′-TCCCTGGAGAAGAGCTACG-3′，下游5′-GTAGTTTCGTGGATGCCACA-3′；ZAG 引物上游5′-GCTTACCTGGAGGAGGAGTG-3′，下游5′-TTCCCTGGGTAGAAGTCGTAG-3′。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡將上述細胞收集于離心管中，PBS 洗滌2 次，重懸于500 μL 結合緩沖液中使細胞密度為2×105個/mL。用5 μL FITCAnnexin V、5 μL PI 在黑暗中染色15 min。1 h 內采用流式細胞儀檢測細胞凋亡百分比。

1.6 細胞內TG、TC 含量測定參照TG、TC 測定試劑盒分析細胞內TG、TC 水平。

1.7 IL-6 和TNF-α 釋放量檢測采用ELISA 試劑盒測定細胞上清液中IL-6 和TNF-α 水平。將細胞上清液、標準品分貝添加至包被孔（預先涂有特異性抗體），37 ℃下孵育1.5 h，向每個孔中添加酶聯抗體37 ℃下孵育1 h，向每個孔中添加生物素抗體37 ℃下孵育30 min；加入終止溶液結束顯色反應。酶標儀測量樣品在450 nm 處的吸光度，繪制標準曲線并計算IL-6 和TNF-α 釋放量。

1.8 蛋白質印跡法分析ZAG、Bcl-2 和Bax 蛋白表達量RIPA 裂解緩沖液孵育細胞10 min，超聲處理細胞三次破碎細胞，4 ℃下12 000 r/min 離心10 min 收集上清液。使用BCA 試劑盒確定蛋白濃度，取等量蛋白樣品上樣至十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳。將蛋白條帶轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜后，用5%脫脂牛奶緩沖液封閉膜1 h，然后將膜與特定的一抗在4 ℃下孵育過夜。再用對應的二抗孵育膜1 h。使用增強化學發光溶液進行顯色反應。Image Lab 6.0 軟件分析各條帶的灰度值，以目的蛋白與內參β-actin 灰度值的比值表示目的蛋白表達量。

1.9 統計學方法使用SPSS 軟件（20.0 版本）進行統計分析，實驗結果均采用均值±標準差表示，兩組比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ZAG 在棕櫚酸誘導的HepG2 細胞中的表達及NALFD 患者肝組織中的表達與對照組比較，棕櫚酸組HepG2 細胞ZAG 在mRNA 和蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05），見圖1A-C、表1。與正常肝組織比較，NALFD 患者肝組織ZAG mRNA和ZAG 蛋白的表達水平顯著降低（P＜0.05），見圖1D。

圖1 ZAG 在棕櫚酸誘導的HepG2 細胞中的表達及NALFD 患者肝組織中的表達Fig.1 Expression of ZAG in HepG2 cells induced by palmitic acid and in liver tissues of NALFD patients

表1 ZAG 在棕櫚酸誘導的HepG2 細胞中的表達Tab.1 Expression of ZAG in HepG2 cells induced by palmitic acid

表1 ZAG 在棕櫚酸誘導的HepG2 細胞中的表達Tab.1 Expression of ZAG in HepG2 cells induced by palmitic acid

注：與對照組相比，*P ＜0.05

2.2 利拉魯肽對棕櫚酸誘導的HepG2 細胞ZAG表達的影響與對照組比較，利拉魯肽組HepG2細胞ZAG mRNA 和ZAG 蛋白表達量顯著升高（P＜0.05）；與棕櫚酸組比較，棕櫚酸+利拉魯肽組HepG2 細胞ZAG mRNA 和ZAG 蛋白表達量顯著升高（P＜0.05）。見圖2、表2。

表2 利拉魯肽對棕櫚酸誘導的HepG2 細胞ZAG 表達的影響Tab.2 Effect of liraglutide on ZAG expression in HepG2 cells induced by palmitic acid

表2 利拉魯肽對棕櫚酸誘導的HepG2 細胞ZAG 表達的影響Tab.2 Effect of liraglutide on ZAG expression in HepG2 cells induced by palmitic acid

注：與對照組相比，*P ＜0.05；與棕櫚酸組相比，#P ＜0.05

圖2 利拉魯肽對棕櫚酸誘導的HepG2 細胞ZAG 表達的影響Fig.2 Effect of liraglutide on ZAG expression in HepG2 cells induced by palmitic acid

2.3 ZAG shRNA、pcDNA-ZAG 轉染效果檢測與NC shRNA 組比 較，ZAG shRNA 組HepG2 細 胞ZAG 蛋白表達量顯著降低（P＜0.05）；與pcDNA 組比較，pcDNA-ZAG 組HepG2 細胞ZAG 蛋白表達量顯著升高（P＜0.05）。見圖3、表3。

表3 Westernblot 檢測ZAG shRNA 和pcDNA-ZAG 的轉染效果Tab.3 The transfection effect of ZAG shRNA and pcDNA-ZAG was detected by Westernblot

表3 Westernblot 檢測ZAG shRNA 和pcDNA-ZAG 的轉染效果Tab.3 The transfection effect of ZAG shRNA and pcDNA-ZAG was detected by Westernblot

注：與NC shRNA 組相比，*P ＜0.05；與pcDNA 組相比：#P ＜0.05

圖3 Western blot 檢測ZAG shRNA 和pcDNA-ZAG 的轉染效果Fig.3 Transfection effect of ZAG shRNA and pcDNA-ZAG detected by Western blot

2.4 利拉魯肽通過ZAG調控棕櫚酸誘導的HepG2細胞的凋亡、脂質代謝和炎癥因子表達與對照組比較，棕櫚酸組HepG2 細胞凋亡率、Bax 蛋白表達量、TG、TC、IL-6、TNF-α 含量顯著升高，Bcl-2 蛋白表達量顯著降低（P＜0.05）；與棕櫚酸組比較，棕櫚酸+利拉魯肽組HepG2 細胞凋亡率、Bax 蛋白表達量、TG、TC、IL-6、TNF-α 含量顯著降低，Bcl-2蛋白表達量顯著升高（P＜0.05）；與棕櫚酸+利拉魯肽組比較，棕櫚酸+利拉魯肽+ZAG shRNA 組HepG2 細胞凋亡率、Bax 蛋白表達量、TG、TC、IL-6、TNF-α 含量顯著升高，Bcl-2 蛋白表達量顯著降低（P＜0.05）。見圖4、表4。

圖4 利拉魯肽通過ZAG 調控棕櫚酸誘導的HepG2 細胞的凋亡Fig.4 Liraglutide regulates palmitic acid-induced apoptosis in HepG2 cells via ZAG

表4 利拉魯肽通過ZAG 調控棕櫚酸誘導的HepG2 細胞的凋亡、脂質代謝和炎癥因子表達Tab.4 Liraglutide regulates palmitic acid-induced apoptosis，lipid metabolism and inflamMolatory factor expression of HepG2 cells by ZAG

表4 利拉魯肽通過ZAG 調控棕櫚酸誘導的HepG2 細胞的凋亡、脂質代謝和炎癥因子表達Tab.4 Liraglutide regulates palmitic acid-induced apoptosis，lipid metabolism and inflamMolatory factor expression of HepG2 cells by ZAG

注：與對照組相比，*P ＜0.05；與棕櫚酸組相比，#P ＜0.05；與棕櫚酸組+利拉魯肽組相比，&P ＜0.05

2.5 利拉魯肽聯合ZAG對棕櫚酸誘導的HepG2細胞凋亡、脂質代謝和炎癥因子表達的影響與對照組比較，棕櫚酸組HepG2 細胞凋亡率、Bax 蛋白表達量、TG、TC、IL-6、TNF-α 含量顯著升高，Bcl-2蛋白表達量顯著降低（P＜0.05）；與棕櫚酸組比較，棕櫚酸+利拉魯肽組HepG2 細胞凋亡率、Bax 蛋白表達量、TG、TC、IL-6、TNF-α 含量顯著降低，Bcl-2蛋白表達量顯著升高（P＜0.05）；與棕櫚酸組比較，棕櫚酸+pcDNA-ZAG 組HepG2 細胞凋亡率、Bax 蛋白表達量、TG、TC、IL-6、TNF-α 含量顯著降低，Bcl-2 蛋白表達量顯著升高（P＜0.05）；與棕櫚酸+利拉魯肽組、棕櫚酸+pcDNA-ZAG 組比較，棕櫚酸+利拉魯肽+pcDNA-ZAG 組HepG2 細胞凋亡率、Bax 蛋白表達量、TG、TC、IL-6、TNF-α 含量顯著降低，Bcl-2 蛋白表達量顯著升高（P＜0.05）。見圖5、表5。

表5 利拉魯肽聯合ZAG 對棕櫚酸誘導的HepG2 細胞凋亡、脂質代謝和炎癥因子表達的影響Tab.5 Effects of liraglutide combined with ZAG on palmitic acid-induced apoptosis，lipid metabolism and expression of inflamMolatory factors in HepG2 cells

表5 利拉魯肽聯合ZAG 對棕櫚酸誘導的HepG2 細胞凋亡、脂質代謝和炎癥因子表達的影響Tab.5 Effects of liraglutide combined with ZAG on palmitic acid-induced apoptosis，lipid metabolism and expression of inflamMolatory factors in HepG2 cells

注：與對照組相比，*P ＜0.05；與棕櫚酸組相比，#P ＜0.05；與棕櫚酸組+利拉魯肽組相比，&P ＜0.05；與棕櫚酸+pcDNA-ZAG組相比，▽P ＜0.05

圖5 利拉魯肽聯合ZAG 對棕櫚酸誘導的HepG2 細胞凋亡的影響Fig.5 Effects of liraglutide combined with ZAG on palmitic acid-induced apoptosis in HepG2 cells

3 討論

NAFLD 以其發病率、經濟負擔沉重而受到廣泛關注［7］。研究表明，脂質沉積、氧化應激、脂質過氧化和炎癥反應參與了NAFLD 進展［8-9］。利拉魯肽干預可降低HepG2 細胞中脂肪酸合成酶水平，增加甘油三酯脂肪酶水平，改善HepG2 細胞脂代謝［10］。細胞中總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）水平是判斷脂質沉積的重要指標［11］。本研究中棕櫚酸處理顯著提高HepG2 細胞中TC 和TG 水平，而利拉魯肽干預顯著逆轉這一改變，說明利拉魯肽可逆轉棕櫚酸誘導的HepG2 細胞脂質沉積。進一步研究發現，利拉魯肽干預還可減弱棕櫚酸誘導的HepG2 細胞凋亡。Bcl-2 和Bax 蛋白是參與細胞凋亡調控的重要因子［12］，Bax 移位至線粒體并促進其膜通透性改變進而導致凋亡誘導因子釋放進而發揮促凋亡作用，而Bcl-2 則通過與Bax 結合抑制Bax 活性進而發揮抗凋亡作用［13］。本研究中利拉魯肽干預顯著下調棕櫚酸誘導HepG2 細胞中Bax蛋白表達，上調Bcl-2 蛋白表達，與利拉魯肽的抗凋亡作用吻合。IL-6、TNF-α 是最常用的炎性細胞因子［14-15］，研究指出TNF-α 和IL-6 表達增加與肝細胞脂肪酸攝取增加，脂質積聚以及肝細胞脂毒性相關［16］。本研究中利拉魯肽干預顯著降低棕櫚酸誘導HepG2 細胞中TNF-α 和IL-6 水平，說明利拉魯肽可減輕棕櫚酸誘導HepG2 細胞炎癥反應。

ZAG 是一種主要的組織相容性復合物Ⅰ分子和脂質動員因子，可促進脂質代謝和葡萄糖利用，并調節胰島素敏感性。ZAG 除存在于脂肪組織外，其在骨骼肌、腦組織、腎臟以及肝臟亦存在廣泛表達［17-18］。本研究發現NALFD 患者肝組織、棕櫚酸誘導HepG2 細胞中ZAG 表達降低，而利拉魯肽干預顯著增加HepG2 細胞、棕櫚酸誘導HepG2細胞中ZAG 表達量，提示利拉魯肽對棕櫚酸誘導的HepG2 細胞脂毒性損傷保護作用可能與調節ZAG 表達有關。本研究發現過表達ZAG 顯著抑制棕櫚酸誘導的HepG2 細胞凋亡，并降低TC、TG 水平，說明ZAG 可減輕棕櫚酸誘導的HepG2 細胞凋亡、脂質積累和炎癥反應。XIAO 等［19］研究證實ZAG 過表達可顯著抑制脂肪生成、促進脂肪分解、脂肪酸氧化，進而減弱棕櫚酸誘導的細胞內脂肪積累，與本研究發現基本吻合。NF-κB 是機體重要的炎癥反應轉錄信號調節因子，其通過激活下游炎癥因子IL-6 和TNF-α 轉錄，參與啟動和擴大炎癥反應，過表達ZAG 通過抑制NF-κB 途徑顯著抑制棕櫚酸誘導的HepG2 細胞炎癥反應［20-21］。本研究中過表達ZAG 顯著降低棕櫚酸誘導后HepG2細胞中IL-6 和TNF-α 水平，說明ZAG 可能通過調控NF-κB 途證發揮抗炎作用。進一步研究發現，沉默ZAG 表達顯著減弱利拉魯肽對棕櫚酸誘導的HepG2 細胞凋亡、脂質沉積以及炎癥反應的影響，過表達ZAG 則增強利拉魯肽對棕櫚酸誘導的HepG2 細胞凋亡、脂質積累和炎癥反應的保護作用。

綜上所述，利拉魯肽可減輕棕櫚酸誘導HepG2 細胞凋亡、脂質積累和炎癥反應，其機制與利拉魯肽上調ZAG 表達有關，本研究為利拉魯肽防治非酒精性脂肪性肝病提供了理論依據。