卵泡素樣3基因在結腸癌組織中的表達及其與預后的關系

郭濤 辛振 王富豪

淮北礦工總醫(yī)院胃腸外科（安徽淮北 235000）

結腸癌是全球第三大常見癌癥［1-2］。雖然結腸癌的治療已經(jīng)取得了很大的進展，但是結腸癌患者的高復發(fā)率仍然是臨床實踐中的主要問題［3-4］。有效抑制結腸癌細胞轉移的方法有限，對于遠處轉移的患者沒有令人滿意的治療方法。大量的研究對結腸癌復發(fā)的機制進行了研究，這是解決臨床問題的基石。

卵泡素樣3（FSTL3，也稱FSRP 或FLRG）是FSTL 家族的成員。FSTL3 是一種新的細胞因子，可調(diào)節(jié)胰島素敏感性和抵消激活素或肌生成抑制素信號。最近的研究表明，F(xiàn)STL3 參與調(diào)節(jié)葡萄糖和脂肪穩(wěn)態(tài)、睪丸老化和睪丸大小［5］、骨骼重塑、骨關節(jié)炎、非小細胞肺癌［6］和其他生理過程或疾病。此外，還發(fā)現(xiàn)FSTL3 可以調(diào)節(jié)腫瘤的進展，例如，F(xiàn)STL3 在侵襲性乳腺癌中過表達，通過拮抗內(nèi)源性激活物促進腫瘤細胞的增殖［7］。然而，其在結腸癌中的表達和生物學功能尚不清楚。本研究前期通過分析TCGA 數(shù)據(jù)庫中FSTL3 的結腸癌表達情況，發(fā)現(xiàn)FSTL3 是結腸癌的潛在治療基因和診斷靶點。進一步通過臨床病例數(shù)據(jù)分析其表達及預后，并通過基礎實驗驗證FSTL3 在結腸癌中起到重要的作用。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫分析本研究通過TCGA 數(shù)據(jù)庫下載結腸癌COAD 項目中l(wèi)evel 3 HTSeq-FPKM 格式的RNAseq數(shù)據(jù)。將下載的521例結腸癌數(shù)據(jù)利用perl軟件和R 語言軟件整合，將患者按表達量中位數(shù)分為高表達組和低表達組進行分析和繪圖，并利用數(shù)據(jù)進行結腸癌預后比較及診斷ROC 曲線繪制。

1.2 一般資料選取淮北礦工總醫(yī)院自2015 年1月至2020 年12 月在外科手術的結腸癌組織蠟塊90 例及其配對的癌旁組織。所有患者術前均未接受化療、放療、內(nèi)分泌治療及靶向治療等輔助治療，并于術前均有明確診斷及術后再次診斷為結腸癌。患者均簽署知情同意書，研究方案經(jīng)蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準。

1.3 細胞培養(yǎng)和主要試劑結腸癌細胞SW620細胞購自中科院細胞研究所。DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Hyclone 公司，胎牛血清（FBS）購自浙江天杭生物科技股份有限公司，F(xiàn)STL3 過表達質粒及siRNA 由上海吉瑪公司設計合成，Lipofectamin2000 于Thermo Scientific 公司購買。一抗（FSTL3、GAPDH）均購買于Abcam 公司，二抗購于武漢三鷹生物科技有限公司，Western blot 試劑盒及BCA 蛋白濃度測量試劑盒購自碧云天生物技術公司，四甲基偶氮唑鹽（MTT）購自Biofroxx 公司。Transwell 小室及六孔板購自NEST 公司。

1.4 免疫組化檢測FSTL3 蛋白將結腸癌組織蠟塊90 例及其配對的癌旁組織，進行切片制備、脫臘、復水后對組織進行抗原修復，然后進行免疫反應，滴加一抗（1∶200），4 ℃冰箱孵育過夜。加二抗（1∶500），室溫孵育1 h。DAB 化學染色，蘇木素復染。酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。

1.5 免疫組化結果判斷采用二次計分法：每例標本隨機計數(shù)5 個高倍視野（× 400），計數(shù)每個高倍視野中陽性細胞所占百分比。陽性染色結果判斷：胞漿中的染色面積和棕黃色顆粒決定。染色強度標準如下［8］：以基本色度標準，0 分無色，1 分淡黃色，2 分棕黃色，3 分棕褐色。再將陽性細胞所占百分比計分，0 分為陰性，1 分為陽性細胞＜10%，2分為11%～50%，3 分為51%～75%，4 分為＞75%。用染色強度得分和細胞數(shù)得分的乘積作為判斷表達結果，若積分0～4 分為陰性，4～12 分為陽性。因此，本研究將LYAR 陰性表達患者歸為低表達組，陽性表達歸為高表達組。免疫組化結果由兩名以上高年資病理醫(yī)師同時讀片評定。

1.6 細胞轉染取對數(shù)生長期細胞，于轉染前24 h將細胞以3.0 × 104個/孔接種于6 孔板；轉染時按照脂質體Lipofectamine TM2000 轉染試劑說明書，SW620 細胞分別轉染過表達質粒，記作FSTL3、NC及小干擾RNA，記作si-FSTL3、si-NC（細胞轉染陰性對照NC），轉染時加入相應試劑并混合均勻，將細胞培養(yǎng)基換為無血清培養(yǎng)基，5% CO2、37 ℃條件培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h 后更換新鮮培養(yǎng)基，然后進行后續(xù)實驗。實驗分組：NC 組、FSTL3 組、si-NC 組、si-FSTL3 組。siRNAi-FSTL3 序列為5′-GGAACAAGATCAACCTCCTCGGCTT-3′。

1.7 MTT 法檢測待檢測細胞用胰蛋白酶消化，以5×103個/mL 細胞懸液，每孔200 μL，加入96 孔板中，DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞貼壁后，分別以24、48、72 h 加入MTT 溶液20 μL 混勻，繼續(xù)孵育4 h；每孔加DMSO 150 μL，培養(yǎng)30 min；酶標儀檢測490 nm處的吸光值（OD值），計算細胞增殖抑制率，抑制率=（1-實驗組OD值）/對照組OD值×100%。

1.8 克隆形成實驗轉染24 h 后收集細胞，進行細胞計數(shù)后，將500 個細胞接種于6 孔板內(nèi)，在5%CO2、37 ℃條件培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 周后，棄去培養(yǎng)基，加入4%多聚甲醛，室溫固定20 min，結晶紫染色10 min 后，拍照。

1.9 Transwell 檢測細胞遷移能力無需鋪基質膠外分別取對數(shù)生長期的si-NC 組、si-FSTL3 組、NC 組、FSTL3 組的SW620 細胞，每組設3 個復孔，消化離心后，用無血清培養(yǎng)基重懸于小室中。于37 ℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)24 h；取出小室；PBS清洗2 次，4%多聚甲醛固定15 min，用結晶紫染液室溫下染色10 min；PBS 漂去多余染料，在200×視野下觀察透膜細胞數(shù)。計數(shù)并求平均值，所有實驗重復3 次。

1.10 Western Blot 檢測轉染48 h 的細胞加入預冷的RIPA 裂解液提取總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度；加入蛋白上樣緩沖液，調(diào)整蛋白為相同濃度，95 ℃煮沸5 min 使蛋白變性；10%SDS-PAGE 電泳分離蛋白，分離后的蛋白轉移至PVDF 膜，5%脫脂奶封閉2 h；一抗（FSTL3、GAPDH）按1∶1 000 稀釋，4 ℃搖床孵育過夜，二抗1∶5 000 稀釋，搖床孵育2 h；ECL 發(fā)光試劑，暗室曝光拍照，以Image J 軟件分析目的蛋白，GAPDH 為內(nèi)參計算蛋白的灰度值，以其比值為蛋白的相對表達水平。

1.11 統(tǒng)計學方法采用SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，兩組間比較用配對t檢驗，率的比較采用χ2檢驗，采用受試者工作曲線（ROC）比較診斷效能，單因素及多因素分析采用Cox 比例風險回歸模型，生存分析采用Kaplan-Meier 法計算。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TCGA數(shù)據(jù)庫中FSTl3在結腸癌中的表達及預后情況在TCGA 數(shù)據(jù)庫中，F(xiàn)STL3 基因在非配對組中，相比較于正常組織，在癌組織中的表達量明顯上升（圖1A）。在配對組中，相較于癌旁組織，癌組織中FSTL3 表達明顯較高（圖1B）。以FSTL3的表達量作為診斷結腸癌的指標繪制ROC，曲線下面積0.776（95%CI：0.707～0.846）。以表達量2.186為診斷節(jié)點，靈敏度0.749，特異度0.683，約登指數(shù)1.432，陽性預測值0.965，陰性預測值0.189（圖1C）。對FSTL3 在結腸癌組織的表達進行K-M 生存分析顯示，高表達組的生存率顯著低于低表達組（P＜0.008，圖1D）。

圖1 TCGA 數(shù)據(jù)庫中FSTL3 在結腸癌中的表達及預后情況Fig.1 The expression and prognosis of FSTL3 in colon cancer in the TCGA database

2.2 FSTL3 蛋白表達與結腸癌臨床病理特征的相關性FSTL3在結腸癌中的表達與年齡（P=0.049）、TNM 分期（P=0.033）、浸潤深度（P=0.06）、遠處轉移（P=0.001）有關，而與性別（P=0.386）、淋巴轉移（P=0.215）、分化程度（P=0.565）無關。見表1。

表1 FSTL3 表達與患者臨床病理因素的關系Tab.1 Relationship between FSTL3 expression and clinicopathological factors in patients例

2.3 免疫組化檢測FSTL3 蛋白表達在90 例結腸癌組織蠟塊和與其相匹配的癌旁正常組織中，F(xiàn)STL3 蛋白在癌組織中陽性表達明顯高于癌旁正常組織（P＜0.001），見表2。FSTL3 陽性反應物定位于細胞胞漿中，見圖2。

圖2 免疫組化檢測FSTL3 蛋白在結腸癌組織的表達（×200）Fig.2 The expression of FSTL3 protein in Colon cancer tissues was detected by immunohistochemistry（×200）

2.4 FSTL3 蛋白達與結腸癌患者預后的關系本課題組收集90 例患者資料，隨訪時間60 個月，死亡66 例，總體生存率26.7%。對FSTL3 表達情況進行K-M 分析，發(fā)現(xiàn)結腸癌組織中，F(xiàn)STL3 高表達患者生存率顯著低于低表達患者。見圖3。

圖3 結腸癌患者FSTL3 高表達組與FSTL3 低表達組5 年生存率比較Fig.3 The 5 years survival rate in the FSTL3 overexpression group was significantly lower than that in the FSTL3 low expression group

2.5 結腸癌預后單因素及多因素分析采用Cox比例風險模型分析預后，單因素結果顯示，F(xiàn)STL3高表達，年齡，浸潤深度，遠處轉移是結腸癌的預后因素。多因素結果分析顯示，F(xiàn)STL3 過表達、浸潤深度是結腸癌的預后因素。見表2。

表2 FSTL3 表達以及臨床特征對結腸癌患者生存率的影響Tab.2 The effect of FSTL3 expression and clinical characteristics on the survival rate of colon cancer patients

2.6 FSTL3沉默后的表達水平Western Blot 檢測顯示，與si-NC 組比較，si-FSTL3 組SW620 細胞中FSTL3 的蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），見圖4A。與NC 組比較，F(xiàn)STL3 組SW620 細胞中FSTL3的蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），見圖4B。

圖4 轉染48 h 后結腸癌細胞SW620 中的FSTL3 表達水平Fig.4 The expression level of FSTL3 in colon cancer cell SW620 48 h after transfection

2.7 FSTL3 基因對結腸癌細胞增殖的影響克隆形成實驗檢測顯示，轉染si-FSTL3 后的SW620 細胞形成的細胞集落數(shù)目少于對照組（P＜0.05）。同樣的，過表達FSTL3 后，F(xiàn)STL3 組SW620 細胞形成的細胞集落數(shù)目明顯多于NC 組（P＜0.05），見圖5A。MTT 檢測顯示，與si-NC 組比較，si-FSTL3組結腸癌細胞株SW620 細胞24、48、72 h 增殖率顯著下降（P＜0.05）。同樣的，MTT 檢測顯示，與NC組比較，F(xiàn)STL3 組SW620 細胞24、48、72 h 增殖率顯著上升（P＜0.05），見圖5B。

圖5 FSTL3 對結腸癌細胞增殖的影響Fig.5 The effect of FSTL3 on the proliferation of colon cancercells

2.8 FSTL3 基因對結腸癌細胞遷移的影響Transwell 實驗顯示，與si-NC 組比較，si-FSTL3 組結腸癌細胞株SW620 細胞的遷移細胞數(shù)目顯著降低（P＜0.05）。過表達FSTL3后，與NC組比較，F(xiàn)STL3組SW620 細胞的遷移細胞數(shù)目顯著增高（P＜0.05），見圖6。

圖6 FSTL3 對結腸癌細胞遷移的影響Fig.6 The effect of FSTL3 on the migration of colon cancer cells

3 討論

結腸癌是最常見的消化道癌癥之一，死亡率較高，給全球帶來了巨大的健康負擔。然而，結腸癌的發(fā)病機制尚不清楚。研究表明，越來越多的分子被發(fā)現(xiàn)參與了該疾病的發(fā)生發(fā)展。既往研究發(fā)現(xiàn)FSTL 家族成員在腫瘤中表達異常，并參與腫瘤發(fā)生和進展［9-11］。如FSTL1 在非小細胞肺癌中表達下調(diào)，過表達可顯著抑制細胞增殖、遷移和侵襲，誘導細胞凋亡［12］；而FSTL1 在肝癌中表達上調(diào)，下調(diào)其表達可促進細胞凋亡，抑制細胞增殖［13］。有研究報道FSTL5 在肝細胞癌中表達下調(diào)，過表達可抑制癌細胞存活［14］。FSTL3 作為FSTL 家族的一員，在腫瘤中也存在異常表達的物質。例如，F(xiàn)STL3 可以作為乳腺癌和肝細胞癌的癌癥生物標志物。FSTL3 在乳腺癌中表達上調(diào)，過表達可促進腫瘤的發(fā)生進展。這些結果表明，F(xiàn)STL3 作為一種致癌基因參與了癌癥的發(fā)生發(fā)展。

本研究中，首先通過分析TCGA 數(shù)據(jù)庫中的結腸癌數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)FSTL3 不論是在配對樣本還是非配對樣本中，表達水平都明顯上升。以FSTL3 的表達量作為診斷結腸癌的指標繪制ROC，曲線下面積為0.776，以FSTL3 作為診斷結腸癌的指標，具有一定的準確性。并且FSTL3 高表達患者生存率明顯低于FSTL3 低表達患者，這提示FSTL3 可能是結腸癌的生物學標志物。隨后，收集了90 例結腸癌病例，通過免疫組化檢測了FSTL3 在結腸癌中的表達水平，驗證了TCGA 數(shù)據(jù)庫的結果。同時，發(fā)現(xiàn)FSTL3 在結腸癌中的表達與年齡（P=0.049）、TNM 分期（P=0.033）、浸潤深度（P=0.06）、遠處轉移（P=0.001）有關，而與性別（P=0.386）、淋巴轉移（P=0.215）、分化程度（P=0.565）無關。通過單因素分析顯示，F(xiàn)STL3 高表達、年齡、浸潤深度、遠處轉移是結腸癌的預后因素。多因素結果分析顯示，F(xiàn)STL3 過表達、浸潤深度是結腸癌的預后因素。此外，通過轉染結腸癌細胞SW620 細胞株，得到FSTL3 過表達及沉默細胞株。通過克隆形成實驗及MTT 實驗，發(fā)現(xiàn)過表達FSTL3 相比與對照組，明顯促進結腸癌細胞增殖。相反，敲低FSTL3 表達，結腸癌細胞增殖受到明顯抑制。通過Transwell 實驗，發(fā)現(xiàn)過表達FSTL3，結腸癌細胞遷移明顯增長。相反，敲低FSTL3，結腸癌細胞遷移明顯受到抑制。這些結果都提示FSTL3 可能是一種原癌基因。相較于在前期的研究報道中FSTL3 在非小細胞肺癌及肝癌中，表達異常，本課題組首次發(fā)現(xiàn)FSTL3 在結腸癌中表達上調(diào)，F(xiàn)STL3 的表達量與患者的生存時間有關。同時，進一步進行體外實驗，發(fā)現(xiàn)調(diào)控FSTL3 的表達量，可以調(diào)控結腸癌細胞的增殖、侵襲及遷移。這些發(fā)現(xiàn)為結腸癌的治療提供了新的靶基因。因此可以判斷，檢測結腸癌組織中FSTL3 蛋白量有助于判斷腫瘤的惡性程度和進展狀態(tài)。然而，本研究沒有對FSTL3 在結腸癌中的分子機制進行深入研究。下一步將深入研究FSTL3 在結腸癌中作用機制。

綜上所述，F(xiàn)STL3 在結腸癌組織中高度表達，并且FSTL3 在結腸癌的預后和進展中具有重要意義。此外，敲低其表達可以明顯抑制結腸癌細胞的增殖、遷移，而過表達FSTL3 則有促癌作用。FSTL3 作為一種致癌基因參與了結腸癌的發(fā)生和發(fā)展。