次氯酸鈉消毒劑對水體沉積物細菌群落的影響

蘇靜嫻 ，衛文鋒 ，夏 如 ，鄭曉婷 ，張詩穎 ，倪小婷 ，王 雨

（1.廣州大學 大灣區環境研究院，廣州 510006；2.廣州大學 環境科學與工程學院，廣州 510006）

目前全球范圍內的新型冠狀病毒肺炎疫情仍十分嚴峻[1]，消毒作為切斷病毒傳播途徑的重要手段，在疫情防控中發揮了重要作用[2]。含氯消毒劑溶于水后產生次氯酸，具有殺滅細菌、病毒、真菌、結核桿菌等微生物的特性，可用于公共空間的消毒[3]。然而，目前也存在消毒劑大量甚至過度使用的現象，可能導致殘余的消毒劑經過雨水沖刷等方式流入排水管道、河流、湖泊等水體，對水體沉積物中的微生物生態系統造成影響[4]。

沉積物是河流生態系統的重要組成部分。沉積物孔隙水是污染釋放的主要途徑[5]，其與上覆水之間存在著吸收和釋放的動態平衡，可成為水體中污染物的源或匯[6]。當消毒劑進入水體中，消毒劑的殺菌作用可能會影響沉積物中微生物的群落結構[7]。沉積物中的微生物群落在水體自凈過程中也發揮著重要的作用[8]。當沉積物中的微生物生態系統受到影響時，水體的自凈能力也會隨之改變。例如殘余的含氯消毒劑流入可導致河流中硝化菌群的缺失，破壞水中氨氮-亞硝酸鹽-硝酸鹽的循環體系，降低水體自凈能力，對水生環境與生態系統造成危害[9]。也有研究表明含氯消毒劑不僅能夠殺死環境中的病毒、污水中的有害生物，還能夠殺死水體中的有益生物，過度消毒會危害水生態環境[3]。類似研究也證實了含氯消毒劑進入水環境中后，反應生成消毒副產物，多種消毒副產物具有明確的細胞毒性和基因毒性以及潛在致癌作用等危害，同時消毒副產物可能進入底泥，可能會嚴重影響沉積物中微生物的群落結構[10]。例如2003年非典期間，由于過度消毒，臺灣淡水河及其支流被倒入了大量漂白水等含氯消毒劑，導致含氯量過高，魚群大量死亡，直到半年后才恢復正常，對河流生態系統產生了明顯沖擊[3]。然而，大部分此類研究的重點為水體環境和水質指標，針對消毒劑對沉積物中微生物群落結構與微生物生態的影響缺乏系統研究。

因此，本文針對消毒劑流入水體后，可能對沉積物中微生物群落造成的影響，通過采集潛在的受納河涌與景觀水體的沉積物樣品，加入含氯消毒劑開展模擬實驗，采用高通量測序技術分析消毒劑流入水體后對沉積物微生物群落造成的影響，以期對消毒劑的生態影響與規范使用提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

沉積物樣品采集選擇在廣州市區開展。根據水體周邊環境、水質狀況及水體交替速率，本研究選擇了廣州大學城某河流、廣州大學城中心湖及某住宅區景觀水體進行沉積物樣品采樣，分別命名為River-1、Lake-1、Lake-2。采用重力式柱狀沉積物采樣器對水底淤泥處（0～10 cm）進行采樣，采集完成后及時將沉積物裝入無菌塑封袋中，并采集1.5 L水樣于采樣瓶中，冷藏保存運輸，用于模擬實驗與分子生物學分析。

1.2 理化指標測定

實驗中分別測定了水體中的余氯含量、沉積物中的總磷（TP）、總氮（TN）、硝酸鹽（）、亞硝酸鹽（）和氨氮（）含量。其中水樣經0.45 μm混合纖維素濾膜過濾后，基于DPD（N，N-二乙基-1，4-苯二胺）比色法[11]，選用余氯檢測儀（陸恒LH-M900）測定其余氯值。沉積物經過2 mol/L的KCl溶液浸提后，沉積物與水比例為1∶5，TP的測定采用鉬酸銨分光光度法，TN測定采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法，-N的測定采用鋅鎘還原法，NO-2-N測定采用重氮-偶氮法，-N測定采用次溴酸鈉氧化法[12]。

1.3 模擬實驗設計

1.3.1 消毒劑濃度梯度設置

實驗中的次氯酸鈉消毒劑選用目前公共場所和家庭消毒最常用的84消毒劑開展模擬[3]。根據84消毒劑使用方法，使用前按照原液和水1∶29比例進行稀釋?？紤]到殘余消毒劑在流入自然水體時會被再次稀釋，因此，對消毒劑進行10倍、25倍、100倍的再次稀釋，形成3個分組以及對照組，見表1。

表1 模擬實驗消毒劑投加梯度設置Table 1 Setting of disinfectant dosing gradient in simulation experiment

1.3.2 實驗階段設置

模擬實驗將設置兩個階段進行，第一個階段分析消毒劑投加后對沉積物微生物群落的短期影響（42 h以內），第二個階段分析消毒劑投加后對其的中長期影響（126 h以內）。

第一階段一次性添加消毒劑后，搖晃使其混合均勻，隨后從樣品中抽取適量水樣檢測余氯含量變化至達到穩定階段，同時采集沉積物樣品進行分析。樣品采集間隔為：添加消毒劑后的0 h、3 h、6 h、18 h和42 h。實驗操作過程的0 h時段，指空白組與實驗組分別添加等體積的純水與消毒劑，混勻之后進行取樣所得沉積物樣品。第二階段通過延長實驗周期，并通過多次添加消毒劑，進一步分析余氯進入水體的變化情況以及沉積物細菌群落。實驗周期根據余氯濃度變化達到平穩階段進行確定，在該實驗中從42 h延長至126 h，消毒劑添加和采樣分析時間點為：3 h、6 h、18 h、30 h、54 h、78 h、102 h、126 h。

1.4 分子生物學檢測

微生物多樣性測序分析，包括DNA提取、PCR擴增及Illumina高通量測序，具體步驟為：冷凍保存的約0.25 g干重的沉積物樣品經室溫融化后，采用Power Soil? DNA Isolation Kit基因組DNA提取試劑盒（MoBio，USA）提取沉積物樣品中的總DNA。PCR擴增采用細菌16S rRNA通用引物 338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′） 和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′），用超微量紫外分光光度計NanoVue Plus Spectropho?tometer（GE Healthcare,UK）確定DNA濃度。

PCR樣品的Illumina高通量測序委托上海美吉生物醫藥科技有限公司（http://www.Majorbio.com）在Illumina Miseq PE300平臺上完成。將Miseq測序得到的成對reads拼接為一條序列，并進行質控過濾，根據序列首尾的barcode和引物序列區分樣點得到有效序列，校正序列方向，進行數據優化。優化后的序列用Usearch（vsesion7.0 http://drive5.com/uparse/）在97%的相似度下劃分獨立操作單元（OTU,operational taxonomic units）后，采用RDP classifie貝葉斯算法對OTU達標序列進行分類學分析，通過SILVA rRNA數據庫（Release 128,https://www.arb-silva.de/）進行對比。

1.5 統計分析

基于半度量距離算法（Bray-Curtis）對樣品進行置換方差分析（Permutational multivariate analy?sis of variance,PERMANOVA），分析不同分組因素對樣品差異的解釋度，并使用置換檢驗對劃分的統計學意義進行不同分組間細菌群落組成的顯著性分析，采用非度量多維尺度分析（NMDS）方法分析細菌群落組成結構隨時間變化及添加消毒劑梯度濃度的顯著性差異。使用HemI軟件（Heat?map Illustrator,V1.0）繪制基于平均連接聚類（計算出的兩個聚類之間的距離）和歐幾里德距離（兩組之間計算的距離）的細菌群落結構熱圖。其他圖形繪制使用ORIGIN 9.0軟件完成。

2 結果與討論

2.1 沉積物營養鹽特征

三個采樣點沉積物中TN的濃度為1.79～3.19 mg/g，其中River-1濃度最高，達到3.19 mg/g，濃度最低的Lake-2為1.79 mg/g。沉積物中TP濃度為0.42～0.66 mg/g，其中Lake-1濃度最高，為0.66 mg/g，Lake-2濃度最低，為0.42 mg/g。沉積物中-N濃度為8.56～17.19 mg/kg，其中Lake-1的濃度最低，為8.56 mg/kg，River-1的濃度最高，是Lake-1的兩倍，為17.19 mg/kg。沉積物中-N濃度為0.20～0.65 mg/kg，其中Lake-2的濃度最高，為0.65 mg/kg，River-1的濃度最低，為0.20 mg/kg。沉積物中NO-2-N濃度為0.04～0.12 mg/kg，Lake-1的濃度為0.12 mg/kg，Lake-2與River-1的濃度均為0.04 mg/kg，見表2。

表2 三個采樣點沉積物的營養鹽含量情況Table 2 Nutrient content of sediments from three sampling sites

2.2 模擬過程余氯含量

第一階段向模擬體系（420 mL）中添加1.56 mg/L（G1組）、0.64 mg/L（G2組）、0.16 mg/L（G3組）三個濃度梯度消毒劑20 mL，空白對照組添加相同體積純水（CK組）。消毒劑添加后水體中的余氯濃度迅速下降，之后各個檢測時間點所測得的余氯濃度基本保持平穩，Lake-2的余氯濃度為0.03～0.08 mg/L，Lake-1的余氯濃度為0～0.03 mg/L之間，River-1的余氯濃度處于0～0.03 mg/L之間。在Lake-2中，G1、G2、G3組水體的余氯含量在前3 h時段呈上升趨勢，最高達0.08 mg/L，而后在3～6 h時段驟降至0.02 mg/L，并保持穩定。在Lake-1中，G1、G2組水體的余氯濃度在前3 h時段呈下降趨勢，最低達0.01 mg/L，G3組的略微上升，而后在3～42 h時段大體保持平穩趨勢。在River-1中，前18 h時段G1、G2、G3組水體的余氯濃度呈平緩下降后上升趨勢，最高達0.5 mg/L，而后18～42 h緩慢下降至平穩。空白組余氯濃度變化趨勢相對較平穩。如圖1所示。

第二階段的長期模擬通過延長實驗周期（從42 h增至126 h），并且多次添加消毒劑，分析余氯進入系統的變化情況。在第二階段中，三個地點模擬體系中的余氯波動范圍分別為0.01～0.07 mg/L、0.01～0.05 mg/L和0～0.09 mg/L。每次添加消毒劑后，模擬體系中余氯含量迅速下降。例如Lake-1三組實驗中，消毒劑添加后的余氯理論值為1.56 mg/L、0.64 mg/L和0.16 mg/L（不考慮余氯在體系中的消耗），而實際測量值僅為0.05、0.02、0.03 mg/L，實際值均遠低于理論值，River-1和Lake-2組亦存在相同現象，且對照組與實驗組呈現相似規律。如圖1所示。

圖1 模擬實驗第一階段（a）、第二階段（b）余氯濃度變化情況Fig.1 The change of residual chlorine concentration in the first stage(a)and the second stage(b)of the simulate experiment

由第一、二階段數據可知，一次性添加消毒劑后水體中的余氯值變化不明顯，即使對水體多次添加了較高濃度的次氯酸鈉消毒劑，其余氯濃度仍處于較低水平，添加后未出現余氯濃度突增的現象。余氯濃度平穩且較低可能是由于次氯酸鈉進入水體之后穩定性差，易受光和H+催化發生氧化還原反應迅速降解[13]。其次，次氯酸鈉或者余氯進入水體后，有可能被沉積物吸附，與腐殖質中微生物活動的代謝產物、沉積物中的氨基酸、蛋白質等有機物發生反應，并生成消毒副產物[14]；另外，水體當中的NH3-N也會消耗部分余氯，有研究表明1 mg/LNH3-N理論上可消耗7.6 mg/L的游離氯，余氯濃度降低的同時水體中-N的含量也會隨之下降[9]。

2.3 沉積物細菌群落結構

由于三組實驗中余氯的變化呈現出相似規律，在沉積物細菌群落的分析中選擇了River-1組進行了進一步分析。細菌群落結構的分析選擇對River-1組添加消毒劑后的第一階段初始Ⅰ-0（0 h）、第一階段結束Ⅰ-42（42 h）和第二階段初始Ⅱ-0（同第一階段0 h）、中段Ⅱ-78（78 h）、結束Ⅱ-126（126 h）時的3個濃度梯度和1個對照組共16組沉積物樣品進行分析，見圖2。

圖2 基于97%相似度聚類的序列覆蓋度和樣品物種多樣性指數Fig.2 Sequences coverage and biodiversity indices of samples based on 97% OTU clusters

2.3.1 細菌群落α多樣性

α多樣性指標包括群落多樣性、群落豐富度、群落均勻度。根據所有樣品中最低序列數（24 013條）進行抽平。所有樣品的覆蓋度都在97.4%以上，說明測序深度可以較好地反映沉積物中生物的多樣性和群落特征。

第一階段實驗中，在0 h時段，首次投加消毒劑后實驗組的群落多樣性指數相對于空白組的較高；而在42 h時段，G2和G3組的群落多樣性指數分別從6.26和6.30下降到5.46和5.58，CK組的則從5.50上升至5.74。同時，細菌群落多樣性在不同濃度梯度中呈下降趨勢，濃度相對較高的組的多樣性下降得較快一些，例如G2組的群落多樣性指數在42 h時段相比于0 h時段下降了0.80，G3組的群落多樣性指數在42 h時段相比于0 h時段下降了0.72。實驗組與空白組相比，實驗組的樣品群落的群落多樣性、群落豐富度均低于空白組。

第二階段實驗中，在初始時段，首次投加消毒劑后實驗組的群落多樣性指數相對于空白組的較高。在中段，Ⅱ-78-G2組的群落多樣性指數從6.26下降到5.21，Ⅱ-78-G3組的群落多樣性指數下降到4.94，Ⅱ-78-CK組的為4.66。在模擬實驗結束時，Ⅱ-126-G1組的群落多樣性指數從4.79下降到4.64，Ⅱ-126-G2組的群落多樣性指數從4.80上升到5.21，Ⅱ-126-G3組的群落多樣性指數下降到4.57，Ⅱ-126-CK組的群落多樣性指數為4.99?？瞻捉M在中后期的細菌群落多樣性低于初始階段。實驗組與空白組的群落豐富度、群落均勻度相近，沒有明顯差異。

2.3.2 細菌群落組成分析

總共有20個科水平的細菌物種在水體沉積物中被發現，從科水平上可以看出，擬桿菌科（Bac?teroidaceae）、 厭氧繩菌科（Anaerolineaceae）、Smithellaceae是初始階段的空白組細菌的三個優勢科，其相對豐度分別為17.27%、8.17%和5.37%。在初次投加不同濃度的消毒劑后，初始階段的實驗組中相對豐度較高的是紅環菌科（Rhodocyclace?ae）、叢毛單胞菌科（Comamonadaceae）和厭氧繩菌科；隨著時間的增長和消毒劑的多次投加，實驗組的相對豐度較高的是紅環菌科、叢毛單胞菌科、Sulfurimonadaceae和周蝶菌科（Weeksellace?ae），空白組的優勢科亦發生了更替，紅環菌科成為優勢菌科。

隨著時間的增長和消毒劑的多次投加，三組實驗組的群落結構趨于相近，紅環菌科的相對豐度表現出逐漸上升的趨勢。在126 h時間段的G1、G2、G3和CK四個組的沉積物中紅環菌科的相對豐度較高，分別為23.75%、15.91%、24.25%和18.18%，是優勢科。其他的細菌科，如厭氧繩菌科、Smithellaceae在后期各采樣時間段中的相對豐度都較少，不再是優勢種。在實驗后期實驗組與空白組的優勢種相近，有可能是消毒劑在后期對細菌群落的影響降低，使各個實驗組的群落組成受到模擬條件的影響趨于自然變化。

圖3 相對豐度前二十科細菌群落組成熱圖Fig.3 Heatmap of bacterial community composition in the top 20 families of relative abundance

初始階段的空白組優勢科菌均屬厭氧菌，厭氧繩菌科在產甲烷生物系統中，具有降解碳水化合物和其他細胞材料（如氨基酸）的作用[15]，在實驗后期，實驗組與對照組的優勢種相近，群落結構也十分相似，主要為紅環菌科、叢毛單胞菌科、Sulfurimonadaceae和周蝶菌科，紅環菌科可以利用不同的有機底物作碳源和電子供體進行厭氧光照生長[16]，分解能力較強，適應缺氧甚至完全厭氧的環境條件[17]。有學者發現溶解氧的變化會影響細菌群落結構和生態功能，例如當水體處在缺氧狀態時，叢毛單胞菌科會在群落中占據主導地位[18]，由此說明消毒劑的投加在中、前期對細菌群落的新陳代謝、細菌生長有著顯著的影響，可能抑制了產甲烷菌的生長，而有利于厭氧光照代謝的菌種的生長，因而使群落的優勢種發生了更替。但在實驗后期，實驗環境條件對微生物群落造成的影響比消毒劑帶來的更大，如光照、混勻過程及取樣時對樣品的攪拌等因素，使沉積物中細菌群落的生存環境發生改變進而造成更顯著的影響。

細菌群落結構呈現出按照消毒劑投加時間分組聚類的趨勢[PERMANOVA檢驗，P=0.001；圖4（a）]，在OTU水平上Ⅰ-0（初始）組和Ⅰ-42組的實驗組均與其空白組的距離較遠，且各自聚集為一組。說明Ⅰ-0組、Ⅰ-42組在添加消毒劑之后，其細菌群落結構發生了變化，可能是由于次氯酸鈉具有強氧化性，在水中形成的次氯酸可與細胞壁發生作用，與蛋白質發生氧化作用而導致擬桿菌科、厭氧繩菌科等細菌死亡，使之不再是優勢科[19]；同時，含氯消毒劑對細菌繁殖體、病毒、真菌孢子及細菌芽孢都有強大的殺滅作用[20]，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌、分支桿菌和厭氧菌均可達7個log值的殺滅率[21]，消毒劑的投加迅速使擬桿菌科、厭氧繩菌科、Smithellace?ae等受影響閾值較低的菌體滅活，而分解能力較強，適應缺氧甚至完全厭氧環境條件的紅環菌科、叢毛單胞菌科、Sulfurimonadaceae和周蝶菌科成了優勢菌科。同時Ⅰ-0組與Ⅱ-78組和Ⅱ-126組的距離相差也較大，但是Ⅱ-78組與Ⅱ-126組分布已經較為接近，表明這兩組的細菌群落組成較為類似，可能是由于實驗周期時間較長，投加的不同濃度消毒劑的影響有限，沉積物生境的改變對細菌群落的影響比消毒劑帶來的更加顯著。

而細菌群落結構在不同濃度分組中未呈現聚類規律[PERMANOVA 檢驗，P=0.915；圖 4（b）]，過往實驗結果顯示，濃度為5.0 mg/L、10.0 mg/L、20.0 mg/L的消毒劑可有效滅菌，低濃度次氯酸鈉（1.0 mg/L、2.5 mg/L、5.0 mg/L）在消毒初期對細菌有較強的刺激作用，但不影響模擬實驗中微生物生態系統的恢復，而高濃度（10.0、20.0 mg/L）的消毒劑會對微生物生態系統造成嚴重破壞，且在消毒劑停止投加后也不能恢復[22]，由此推測未呈現聚類規律可能是由于實驗現有設置的濃度梯度對沉積物的影響有限，使之未能產生如中、前期的顯著影響，也進一步說明了殘余低濃度消毒劑對水體沉積物中細菌群落結構影響有限。

圖4 基于非度量多維尺度分析不同時間段（a）和不同濃度梯度（b）水體細菌群落Fig.4 Non-metric multidimensional scale analysis of bacterial community in different time periods(a)and different concentra?tion gradients(b)

3 結論

1）沉積物的營養鹽指標表明沉積物的理化特性均處于良好狀態，無嚴重污染情況。多次添加較高濃度的次氯酸鈉消毒劑進入水體中，其余氯濃度均處于較低水平，未出現余氯濃度突增的現象。

2）消毒劑的多次投加與周期長短是影響細菌群落多樣性的關鍵因素，群落α多樣性指數隨時間呈現先上升后下降的趨勢。

3）含氯消毒劑短期內在沉積物中沒有明顯的積累現象，但消毒劑的投加在中、前期仍對沉積物中的微生物群落造成了影響，會導致生物群落的多樣性和豐富度減小并影響其群落的結構，使優勢菌科由擬桿菌科、厭氧繩菌科、Smithellaceae變為紅環菌科、叢毛單胞菌科、Sulfurimonadaceae和周蝶菌科。