2型糖尿病患者循環CD4+T細胞亞群與腎臟損傷的相關性研究

程 亮，徐 永

(1.徐州醫科大學附屬淮安醫院內分泌科，江蘇 淮安 223002；2.徐州醫科大學附屬淮安醫院腎內科，江蘇 淮安 223002)

糖尿病腎臟病(diabetic kidney disease,DKD)是2型糖尿病(type 2 diabetes milletus,T2DM)最常見的慢性并發癥，也是導致T2DM患者病死率增加的主要原因之一。DKD早期表現為腎小球濾過率(glomerular filtration rate,GFR)增加，特征是腎小球肥大，腎小球系膜細胞增生和細胞外基質增加；隨著病情的發展，患者GFR水平逐漸下降，表現為腎小球基底膜彌漫性增厚，系膜基質增生，甚至腎小管萎縮，并最終進展為終末期腎臟病(end stage renal disease,EASD)[1]。傳統觀點認為，代謝紊亂和血流動力學異常是DKD的主要致病因素[2]。然而，隨著慢性低級別炎癥狀態與T2DM之間的關系被揭示，免疫與炎癥機制在DKD發展過程中作用受到了廣泛關注，T細胞激活、單核-巨噬細胞募集、以及釋放炎癥細胞因子被認為參與了DKD的發生發展[3]。基于此，本研究通過檢測T2DM患者外周血CD4+T細胞亞群，并分析其與腎功能變化之間的關系，旨在探討CD4+T細胞在DKD發生發展過程中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究在徐州醫科大學附屬淮安醫院開展研究受試者招募工作，招募日期為2019年1月—2020年12月。T2DM診斷符合1999年世界衛生組織(World Health Organization，WHO)公布的糖尿病診斷標準。排除標準：①嚴重肝、腎功能不全的患者；②合并糖尿病急性并發癥、感染性疾病、自身免疫性疾病或腫瘤的患者；③近期有創傷或手術病史的患者；④近3個月曾接受過全身糖皮質激素或其他可能影響免疫系統藥物治療的患者。共有113例T2DM患者納入研究。依據是否合并DKD，入組T2DM患者被分為兩組，T2DM組和DKD組。DKD診斷參照《糖尿病腎臟病診治專家共識》，即微量白蛋白尿[尿白蛋白/肌酐比值(urinary albumin to creatinine ratio，ACR)30～<300 mg/g)]或大量白蛋白尿(ACR≥300 mg/g)或估算腎小球濾過率(estimate the glomerular filtration rate，eGFR)下降[eGFR<60 mL·min-1·1.73 m-2][4]。T2DM患者中，T2DM組63例，男性25例，女性28例，年齡44～74歲，平均(59.6±12.8)歲；DKD組50例，男性20例，女性30例，年齡46～77歲，平均(60.9±11.9)歲。另外選取30例于2019年1月—2020年12月在徐州醫科大學附屬淮安醫院體檢的健康志愿者作為對照組(NC組)，要求血糖在正常范圍內、無T2DM家族史、且無臨床確診疾病。正常對照組30例，男性13例，女性17例，年齡46～72歲，平均(58.2±10.0)歲。三組性別和年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

本研究經醫院倫理委員會批準，所有受試者均已簽署了書面知情同意書。

1.2研究方法 收集受試者的性別、年齡、身高、體重、收縮壓(systolic blood pressure，SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)等人口統計數據，并計算體重指數(body mass index,BMI)。禁食8 h后，留取空腹靜脈血，檢測空腹血糖(fasting plasma glucose，FPG)、糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin，HbA1c)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglycerides，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)。血糖和血脂采用全自動生化分析儀檢測(HITACHI-7180，日本)，HbA1c采用高效液相色譜分析法檢測(BIO-RAD D-10TM，美國)。eGFR計算公式為：186×血清肌酐(serum creatinine，SCr)-1.154×(年齡)-0.203×0.742(女性)。BMI計算公式為：體重(kg)/身高2(m2)。

1.3流式細胞術分析 肝素抗凝管采集受試者外周肘靜脈血約5 mL，Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)。采用FITC-anti-CD4、PE-anti-CD25和APC-anti-FOXP3標記，流式細胞儀檢測Treg(CD4+CD25+Foxp3+)細胞占CD4+T淋巴細胞的比例；采用PerCP-Cy5.5-anti-CD3、FITC-anti-CD8和PE-anti-IFN-γ標記，流式細胞儀檢測Th1(CD3+CD8-IFN-γ+)占CD3+T細胞比例；采用PerCP-Cy5.5-anti-CD3、FITC-anti-CD8和PE-anti-IL-4標記，流式細胞儀檢測Th2(CD3+CD8-IL-4+)占CD3+T細胞比例。

1.4統計學方法 應用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。計量資料的多組間比較采用單因素方差分析檢驗，在組間比較時，方差齊性選擇LSD-t檢驗，方差不齊選擇LSD-t′檢驗。CD4+T細胞亞群與臨床參數之間的相關性采用Spearman相關性分析，并采用多元線性回歸分析確定CD4+T細胞亞群的影響因素。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1兩組臨床指標及T細胞亞群的比較 與對照組比較，T2DM組和DKD組的SBP、FPG、HbA1c和TC水平明顯升高(P<0.05)；且與T2DM組相比，DKD組SBP、HbA1c、SCr和ACR水平明顯升高(P<0.05)，eGFR水平明顯下降(P<0.05)。通過流式細胞儀檢測發現，與對照組相比，T2DM組和DKD組的外周血Th1細胞比例和Th1/Th2比值明顯升高(P<0.05)，但Tregs細胞比例卻顯著降低(P<0.05)。而且，與T2DM患者相比，DKD組的外周血Th1細胞比例和Th1/Th2比值升高(P<0.05)，Tregs細胞比例下降(P<0.05)。見表1。

表1 受試者的基本臨床特征比較

2.2T2DM患者eGFR與外周血CD4+T細胞亞群的相關性分析 T2DM患者外周血Th1/Th2比值與eGFR呈負相關關系(r=-0.211,P=0.025)；Tregs細胞比例與eGFR呈正相關關系(r=0.276,P=0.003)。

2.3多元線性回歸分析T2DM患者腎功能變化的影響因素 為了明確T2DM患者腎功能變化的影響因素，采用多元逐步回歸分析，以eGFR為因變量，年齡、性別、BMI、SBP、DBP、FPG、HbA1c、TC、TG、LDL-C、HDL-C、Th1、Th2、Th1/Th2比值、以及Tregs為自變量進行分析。結果發現，SBP、Tregs、Th1/Th2比值和TC是T2DM患者eGFR變化的影響因素，回歸方程為eGFR=131.842-0.479×SBP+10.654×Tregs-0.623×Th1/Th2比值+3.169×TC。見表2。

表2 多元逐步回歸分析新診斷T2DM患者eGFR的影響因素

3 討 論

DKD是一種由多種因素共同作用導致的慢性腎臟疾病(chronic kidney disease,CKD)，特征為持續性蛋白尿和腎功能進行性下降。在此過程中，腎素血管緊張素醛固酮系統(renin angiotensin aldosterone system,RAAS)激活導致腎臟血流動力學異常被認為是DKD的主要致病因素[5]。然而，近年來的研究發現，腎臟組織中單核巨噬細胞募集和T淋巴細胞激活，并釋放炎癥細胞因子參與了DKD的發病過程[6]。一方面，長期高血糖可以導致糖基化終末產物(advanced glycation end products,AGEs)蓄積，并與淋巴細胞發生交聯反應，促進淋巴細胞激活和釋放炎癥介質[7]。另一方面，RAAS激活和內皮細胞損傷是淋巴細胞活化增殖和炎癥反應發生的重要環節[8]。

T淋巴細胞可以被分為CD4+輔助性T細胞和CD8+細胞毒性T細胞，分別識別主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex,MHC)Ⅱ類和Ⅰ類分子遞呈的肽類分子。根據功能與細胞因子分泌情況，CD4+T細胞可被分為促炎的Th1和Th17，以及抗炎的Th2和Tregs。一旦被激活，Th1和Th2可以表現出多種炎癥跡象，包括釋放大量的細胞因子。Th1能夠分泌干擾素γ(interferon-γ,INF-γ)、白細胞介素(interleukin，IL)2和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)，并觸發細胞免疫和吞噬細胞依賴性炎癥反應；Th2分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10和IL-13,主要調節抗體反應。相比之下，Tregs是一類主要發揮免疫抑制功能的T細胞亞群，通過細胞接觸抑制效應T細胞增殖，并表達IL-10、轉化生長因子β等細胞因子抑制Th1、Th2和Th17等細胞的免疫應答反應，減輕炎癥反應[9]。本研究中，與對照組相比，T2DM患者外周血Th1細胞比例升高，Tregs細胞比例下降，且Th1/Th2細胞比值明顯升高。這些結果與既往研究結果相符，提示T2DM患者體內Tregs細胞免疫抑制功能下降，Th1、Th2等效應T細胞被激活并參與免疫應答，促進慢性炎癥反應的發生。將T2DM患者進一步分為T2DM組和DKD組后，與T2DM患者相比，DKD組的外周血Th1細胞比例和Th1/Th2比值進一步升高升高，Tregs細胞比例進一步下降。而且，Spearman相關性分析發現，T2DM患者外周血Th1/Th2比值與eGFR呈負相關關系； Tregs細胞比例與eGFR呈正相關關系。多元逐步回歸分析提示Tregs和Th1/Th2是T2DM患者eGFR變化的影響因素。這些研究結果提示，T2DM患者體內存在CD4+T穩態失衡，CD4+T細胞亞群向促炎方向極化，并與T2DM患者腎功能下降密切相關。

既往研究顯示，DKD患者腎活檢標本中存在CD4+T細胞浸潤，并與腎功能下降密切相關，提示CD4+T細胞浸潤與T2DM患者腎臟損傷和DKD進展有關[10]。活化的T細胞可以通過細胞毒作用直接損傷腎臟組織，并可以刺激系膜細胞分泌集落刺激因子1(colony stimulating factor,CSF-1)和單核細胞趨化因子1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)間接導致腎損傷[11]。T細胞表達AGEs受體，與AGEs結合后被激活，IFN-γ合成和分泌增加，加重腎臟組織的免疫炎癥損傷[12]。T2DM患者體內Th1細胞在腎小球歸巢與細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1,ICMA-1)、巨噬細胞移動抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)和P選擇素水平升高有關，這些細胞因子可以引起進一步的腎損傷[13]。而且，動物實驗中，CKD大鼠血清中Th1細胞比例升高，Tregs比例下降，且腎組織中IFN-γ、TNF-α mRNA和蛋白表達水平明顯下降[14]。臨床研究發現，Th1細胞相關炎癥因子在CKD患者腎臟組織損傷中發揮重要作用，包括IFN-γ和IL-2等[15]。

綜上所述，DKD患者體內存在CD4+T細胞穩態失衡，表現為CD4+T細胞亞群向促炎方向極化，外周血促炎Th1表達升高，抗炎Tregs表達下降。而且，T2DM患者外周血CD4+T細胞異常與eGFR水平下降密切相關，提示CD4+T細胞穩態失衡或參與了DKD發生發展。