荷斯坦泌乳牛糞便中益生菌的分離與鑒定

郭曉農，趙詩佳，馬夢慈，許朝陽

(1.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學 生物醫學研究中心 生物工程與技術國家民委重點實驗室，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學 生物醫學研究中心 中國-馬來西亞國家聯合實驗室，甘肅 蘭州 730030)

益生菌(Probiotic) 是指寄宿于宿主皮膚、口腔、生殖系統、胃腸道等部位，在代謝過程中通過調節腸道內菌群平衡而產生有利于健康作用的活性微生物.俄羅斯科學家Mctchnikoff首先發現益生菌有利于機體處于健康狀態[1].迄今為止，人們從多處分離出益生菌并發現其具有多種有益作用[2-4]：可以防止不良菌群滋生，改善腸內微環境[5]，消除致癌因子，刺激機體的免疫機制，調節免疫功能，降低膽固醇等.

腸道微生物及其代謝產物能夠促進宿主進化與宿主功能的成熟，有利于機體對營養的吸收并保持健康.腸道微生物在對飼料降解的過程中還存在競爭和協同作用，能促進腸道微生物間的協調穩定[6].腸道微生物紊亂會影響奶牛對飼料的利用率，進而引起腹瀉等疾病.因此奶牛腸道微環境對奶牛的健康具有重要的研究意義，但目前動物體內益生菌的作用機制尚不明確，還需更加深入的研究.

鑒于此，本實驗對荷斯坦泌乳牛腸道微生物菌群進行分離純化并通過一系列理化性質檢測，分離出對動物生長代謝健康有益的細菌，以期了解荷斯坦泌乳牛腸道中的微生物菌群組成，為開發相關微生物制劑的研究奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 藥品與器材

蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、檸檬酸氫二銨、葡萄糖、蔗糖、吐溫-80、乙酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸錳、瓊脂、蒸餾水、可溶性淀粉、溴甲酚紫、溴甲酚綠、碳酸鈣、氯化鎂、明膠、乙醇、乙醚、二甲基氨基苯甲醛、甲基紅、濃硫酸、草酸銨結晶紫、碘液、番紅.

立式壓力蒸汽滅菌器(LDZX-75KBS)、恒溫恒濕培養箱(HWS)、恒溫振蕩器(THZ-98AB)、超凈工作臺(SW-CJ-2F)、電子天平(AB2U4-S)、培養皿、顯微鏡、載蓋玻片、酒精燈、錐形瓶、量筒、試管、杜氏小管、pH試紙、涂布棒.

1.2 菌種的分離及純化

1.2.1 糞便采集

于12月采集健康狀態良好、近期無用藥情況的10只成年荷斯坦泌乳母牛糞便.將糞便除去雜物后立即裝入自封袋，標記日期、時間和個體名稱，保存于-20 ℃冰箱待測.糞便樣品收集時，為排除尿液交叉污染，剔除有尿液的糞便.

1.2.2 培養基的選擇與配制

本實驗選用MRS培養基從荷斯坦泌乳牛腸道內容物中分離出益生菌.依照早期的研究報道[7]，在本實驗中選用經改良后低pH值的MRS培養基，因加入了刺激因子吐溫-80，從而能夠篩選培養益生菌.此外培養基還應具有一定濃度的乙酸鹽離子.

1.2.3 菌種的富集培養

將采集好的樣品在無菌條件下用藥匙取出半匙接入含有50 mL培養基的100 mL錐形瓶中，然后放入30 ℃恒溫震蕩箱培養12～24 h.

1.2.4 菌種的純化

將富集培養好的菌液在無菌條件下按等梯度10-4～10-6蒸餾水稀釋.用涂布棒將其在MRS培養基上涂布并放于恒溫培養箱30 ℃環境下培養12～24 h.將基礎分離培養基取出，觀察表面菌群生長狀況.選用改良后MRS培養基，在無菌環境下用接種環挑取不同菌落，用四區劃線法做純化培養.按照相同方法重復4～5次.

1.3 菌種的形態觀察與鏡檢

觀察并記錄分離純化后培養皿上細菌顏色、菌落形態及生長狀況[8].將純化好的菌種用革蘭氏染色法進行染色，并做成涂片進行初步鑒定.

1.4 菌種保存

將篩選出的單一菌落在斜面進行接種后，置30 ℃環境中培養24 h，包扎好置于-4 ℃保存.

1.5 菌種理化性質檢測

1.5.1 淀粉水解實驗

采用12～24 h培養時長的純化菌種，用接種環在超凈工作臺(無菌條件下)，從中挑取部分菌落劃線接種于淀粉瓊脂平板.此實驗可以通過觀察滴加碘液后培養基的變化，檢測細菌是否產生淀粉酶.若培養基無色、菌落周圍無透明環則表明淀粉沒有被分解，為陰性反應，反之為陽性反應[9].

1.5.2 明膠液化實驗

在保藏好的斜面培養管中用接種環挑取少許菌落，穿刺接種于明膠基礎培養基試管中[10]，每個菌種設置并標記一個對照組和三個實驗組，放入30 ℃恒溫恒濕培養箱培養12～24 h.大部分細菌不能直接利用大分子物質，而是在生長代謝過程中通過產生相應的胞外酶來將其水解，以便于細菌吸收小分子物質.通過觀察明膠培養基是否液化，分析細菌是否產生相應的胞外酶.

1.5.3 甲基紅檢測實驗

甲基紅通常作為酸性指示劑，用來檢測細菌產酸能力的強弱.其pH值較低，處于4.4與6.0之間，其pK值為5.0.因此當培養液pH在5.0以下時指示劑紅色增強，反之則隨堿度增強黃色逐漸加深.往三角瓶中倒入滅菌MRS液體培養基50 mL，在超凈工作臺無菌環境下挑取些許純化后的單細菌菌落接種于其中，再將其放置于30 ℃培養箱環境下24 h.每天用吸量管吸取菌液1 mL，向其中滴加1或2滴甲基紅酸性指示劑，從第二天開始直到出現陽性或到5天仍然呈現為陰性，便可判定結果.

1.5.4 吲哚實驗

某些細菌在其生長代謝過程中可以產生能夠分解色氨酸的酶，進而產生的吲哚可與對二甲基苯甲醛出現顯色反應.從斜面培養管用接種環挑取些許菌落接種于蛋白胨水培養基，每個菌種設置并標記三個實驗組和一個對照組.將接菌后的試管放置于30 ℃恒溫培養箱中24 h.

1.5.5 糖酵解實驗

糖酵解實驗主要是研究細菌產能來源和是否產氣[11].而產氣這一特點則對動物健康生長無益.分別制作三個含有蔗糖和葡萄糖培養液的試管，標記出對照組和實驗組，滅菌待用.向試管中接種對應少許純化后的細菌菌苔.往杜氏小管中倒入培養液，倒置于試管底部，放置于30 ℃恒溫恒濕培養箱中24 h.

2 結果

2.1 分離純化結果

2.1.1 富集培養

將兩個樣品進行富集培養后涂布于平板上(圖1,圖2).觀察原始菌落圖片可看出，在不同稀釋梯度條件下，菌群生長狀況及其種類明顯不一樣.圖2A培養皿中菌落太密集，圖2C培養皿中菌落數太少，圖1B和圖1C培養皿中有白斑和疑似雜菌污染，因此最終選擇圖1A培養皿中的菌落作為分離純化目標菌.

A、B、C中的稀釋倍數依次為10-4、10-5、10-6

A、B、C中的稀釋倍數依次為10-4、10-5、10-6

2.1.2 分離純化

通過觀察，純化后的各個細菌宏觀形態各不相同：1號細菌呈現圓形、邊緣光滑、近似白色；2號細菌呈現白色、表面光滑；3號細菌呈現半透明和邊緣輕微透明、表面濕潤、有酸味；4號細菌多數呈現半透明、表面濕潤；5號細菌呈現灰白色、表面光滑、有褶皺；6號細菌呈現白色、表面光滑、濕潤；7號細菌呈現圓形、白色、光滑、表面黏稠；8號細菌呈現白色、面積大、邊緣不平整，表面凸起.

對微觀下各個細菌形態進行觀察，發現其特征有差異：1號細菌呈現紫色、雙球狀、鏈狀；2號細菌呈現紫色(偏紅)、桿狀、有內部顆粒；3、4號細菌呈現紅色、桿狀；5號細菌呈現藍紫色、桿狀、有顆粒；6號細菌呈紅色、桿狀；7號細菌呈紫色、桿狀及鏈桿狀；8號細菌呈現紫色、四片狀.細菌經分離純化后用革蘭氏染色法將不同菌種進行染色和鏡檢.根據菌落特征可以進行細菌的初步檢查和屬性判斷，得到的菌株形態特征及革蘭氏染色結果分別見圖3和圖4.

A：1號細菌單菌落圖；B：2號細菌單菌落圖；C：3號細菌單菌落圖；D：4號細菌單菌落圖；E：5號細菌單菌落圖；F：6號細菌單菌落圖；G：7號細菌單菌落圖；H：8號細菌單菌落圖

A：1號細菌微觀圖；B：2號細菌微觀圖；C：3號細菌微觀圖；D：4號細菌微觀圖；E：5號細菌微觀圖；F：6號細菌微觀圖；G：7號細菌微觀圖；H：8號細菌微觀圖

2.2 實驗結果理化性質檢測

2.2.1 甲基紅實驗

根據實驗結果(表1)1號菌液由第一天橙黃變為穩定的深紅色，2號菌液則由粉紅轉變為穩定的深紅色；3、4、6號菌液檢測時則始終表現為黃色；5號菌液由最初的橙黃轉變為粉紅，最后變為深紅色；7、8號菌液由粉紅轉變為穩定的深紅色.這種現象表明，1、2、5、7、8號細菌在新陳代謝過程中產酸量不同.

表1 甲基紅實驗現象

2.2.2 淀粉水解實驗

實驗發現，1、2、5、7、8號菌種檢測時菌落周圍出現透明環，表明這幾種細菌可產生淀粉酶.

2.2.3 糖酵解實驗

實驗發現，1、2、5、7、8號菌種在單糖發酵中產生氣泡且培養液顏色轉化為黃色.多糖發酵中1、2、5、7、8號菌種在發酵過程中產生氣泡且培養液顏色也轉化為黃色,實驗結果見表2.

表2 糖酵解實驗現象

2.2.4 吲哚實驗

吲哚檢測實驗中1、2、5、7、8號試管內皆出現陰性反應，在新陳代謝過程中不產生吲哚.實驗結果見表3.

表3 吲哚實驗現象

2.2.5 明膠液化實驗

明膠液化實驗中1、7號試管內培養基發生液化，表明這兩種細菌可產生明膠酶來分解大分子蛋白質.其余試管與對照組相比均沒有出現液化現象.

3 分析與討論

人或動物腸道是微生物在動物機體內的棲息地，其益生機制因作用關系復雜而難以闡明[12].適于生產的益生菌數量較少且大多具有局限性，因此欲進一步研究還需篩選更多優良益生菌.

根據實驗結果分析，并參考《伯杰細菌手冊》判斷：1號細菌為嗜熱鏈球菌屬；2號細菌為乳桿菌屬；3、4、6號細菌為大腸桿菌屬；5號細菌為芽孢桿菌屬；7號細菌為嗜酸乳桿菌屬；8號細菌為片球菌屬.這些細菌在荷斯坦泌乳牛胃腸道中為主要寄生細菌，桿菌種類與球菌種類比較豐富.嗜熱鏈球菌存在于奶牛腸道中，可調整菌群平衡，是奶牛腸道內正常菌群之一[13].植物乳桿菌作為飼料及食品中常用益生菌[14]，出現于動物機體內，表明其食物中含有植物發酵產品，但也不排除自身胃腸道內本就含有的可能.芽孢桿菌以活菌形式進入胃腸道后，可調節腸道菌群平衡[15].嗜酸乳桿菌能夠增強小腸中淀粉酶等的活性，可提高日糧中營養物質消化率[16].可見，荷斯坦泌乳牛糞便中分離的益生菌對動物生長具有重要意義.此外，根據前人的研究得出，不同動物其腸道益生菌種類存在差異[17-18].根據鄭藝等[19]研究發現，飲食、宿主基因型、年齡、疾病、藥物等因素對益生菌分布具有重要影響.

對于益生菌是如何影響人或動物微生態及益生菌自身生物學特性，目前認識尚不透徹，從而對益生菌的深度研究受到局限.近年來，關于腸道微生物群的研究成為熱點.對腸道微生態的研究還需更加深入，以便安全有效地應用于腸道微生物群的預防與治療[20].