不同類型宮頸癌人乳頭瘤病毒高危亞型與相關蛋白表達分析

陳 晨 王浩淵

1.廣東省江門市中心醫院腫瘤科，廣東江門 529030；2.廣東省江門市中心醫院重癥醫學科，廣東江門 529030

宮頸癌是嚴重威脅女性身體健康與生命安全的婦科惡性腫瘤之一，近年來發病率呈現年輕化和上升趨勢[1]。宮頸癌病理分類主要包括鱗癌和腺癌，其中以鱗癌最為常見，約占90%，腺癌約占5%[2]，但由于腺癌臨床預后明顯低于鱗癌，故進一步明確宮頸鱗癌及腺癌的發生、發展機制對明確宮頸癌發病機理、指導臨床干預均有重要的意義和作用。人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染其病毒 DNA 能夠同宮頸上皮細胞DNA整合，激發自身的免疫系統，對病毒進行清除，但同時也引發局部的上皮損傷，引起宿主細胞的增殖異常，引起鱗狀上皮內病變，增加宮頸癌的發生概率[3-4]。HPV不同亞型其致病能力有差異，其中高危型HPV在宮頸癌的形成及發展發揮重要作用[5]。但由于目前宮頸癌發生機制尚未完全明確，且不同類型宮頸癌與HPV高危亞型的關系仍處于研究探索階段，進一步觀察不同類型宮頸癌中HPV高危亞型的分布特征及其相關蛋白表達的差異，對進一步明確不同類型宮頸癌發生機制及指導基礎實驗的開展具有重要的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月至2020年2月于江門市中心醫院確診的宮頸癌合并高危型HPV感染患者120例為研究對象。其中年齡26～68歲，平均（50.35±4.46）歲；病理類型：腺癌34例，鱗癌86例；國際婦產科聯盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）分期：Ⅰ～Ⅱ期88例，Ⅲ～Ⅳ期32例；組織學分級：Ⅰ級14例，Ⅱ級29例，Ⅲ級77例；病程1～4年，平均（1.89±0.58）年。

納入標準：①初診為宮頸癌且擇期手術；②均行術中病理檢查確診；③均行HPV檢測且HPV亞型均為高危型；④無其他婦科傳染性疾病；⑤無其他臟器原發性腫瘤；⑥所有患者及其家屬均知情同意。排除標準：①臨床資料不全者；②入組前行相關治療者。本研究經醫院醫學倫理委員會審核批準。

1.2 方法

1.2.1 宮頸分泌物HPV病毒檢測 術中以窺器暴露子宮頸，擦凈子宮頸口分泌物，使用專用刷插入子宮頸口旋轉3周，收集宮頸口及頸管脫落上皮細胞，收集完畢后即刻送檢。第二代雜交捕獲技術（hybrid capture，HC2）分析HPV亞型，所有操作均由同一檢驗師完成，結果判定，HPV相對光單位（relative light unit，RLU）>0.8～1.0即判定為陽性，通過HC2高危型HPV檢測技術篩查HPV高危亞型，包括HPV l6、18、31、33、35、45、51、52、56、58 型和 HPV 61 型等[6]。

1.2.2 癌組織病理類型檢測 所有患者于術中收集宮頸癌組織和癌旁組織，腫瘤組織離體后半小時內于腫瘤組織縱切面的非壞死區域采集標本，癌旁組織于腫瘤組織邊緣5 cm處采集，離體后均經焦碳酸二乙酯水清洗，送快速病理與免疫組化檢測。

1.2.3 蛋白免疫組化檢測 采用SP法對宮頸癌組織和癌旁組織進行免疫組化染色，相關試劑均購自Abcam公司，相關操作均由同一組醫師進行，具體步驟參照試劑盒說明。選取宮頸鱗癌與腺癌中占比最高的HPV高危亞型進行蛋白染色結果分析，目標蛋白包括 E6、E7、P53 和 Rb 蛋白，E6、E7 蛋白陽性判定以試劑盒內相應的蛋白陽性模板為準，P53和Rb蛋白采用二級計分法，染色強度得分為0、1、2、3。陽性細胞百分比≤10%、11%～50%、51%～75%、≥76%分別對應得分 1、2、3、4，半定量標準=細胞的染色強度×陽性細胞的百分比，陰性值為0～3，陽性值為>3[7]。

1.3 觀察指標

①宮頸癌不同病理類型的臨床特征分布；②宮頸癌不同病理類型下HPV高危亞型表達情況；③宮頸癌不同病理類型E6、E7、P53和Rb蛋白表達情況；④HPV高危亞型與E6、E7、P53和Rb蛋白表達的相關性。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗；亞型與蛋白表達的相關性采用Spearman相關性分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 宮頸癌不同病理類型的臨床特征分布

病理學結果顯示，120例宮頸癌患者腺癌34例，鱗癌86例，宮頸癌不同病理類型下年齡、卡氏評分、FIGO分期、組織學分級和病灶大小等臨床特征分布比較，差異均無統計學意義（P>0.05）（表 1）。

表1 宮頸癌不同病理類型的臨床特征分布（例）

2.2 宮頸癌不同病理類型患者HPV高危表型分布

宮頸腺癌以HPV 18亞型為主，占64.71%，其中單一感染27例，多重感染7例，多重感染率為20.59%；宮頸鱗癌以HPV 16亞型為主，占62.79%，其中單一感染81例，多重感染5例，多重感染率為5.81%。宮頸腺癌的HPV 18亞型占比高于鱗癌，HPV 16亞型占比低于鱗癌，且宮頸腺癌的多重感染率高于鱗癌，差異有統計學意義（P＜0.05）（表2）。宮頸鱗癌及腺癌患者中均無HPV 31型、HPV 35型、HPV 51型。

表2 宮頸癌不同病理類型患者HPV高危表型分布[n（%）]

2.3 宮頸癌不同病理類型E6、E7、P53和Rb蛋白陽性表達率的比較

蛋白免疫組化檢測結果顯示，宮頸腺癌和鱗癌E6蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05）；而宮頸腺癌E7蛋白表達高于宮頸鱗癌，P53和Rb蛋白表達低于宮頸鱗癌，差異有統計學意義（P＜0.05）（表 3）。

表3 宮頸癌不同病理類型E6、E7、P53和Rb蛋白陽性表達率的比較[n（%）]

2.4 宮頸癌患者 HPV 16、HPV 18 亞型與 E6、E7、P53和Rb蛋白表達的相關性分析

結果顯示，宮頸癌患者HPV 16亞型、HPV 18亞型與E6、E7、P53和Rb蛋白陽性表達均呈正相關（P＜0.05）（表 4）。

表4 宮頸癌患者HPV 16、HPV 18亞型與E6、E7、P53和Rb蛋白表達的相關性分析

3 討論

現已證實，HPV感染是宮頸上皮內瘤變、宮頸癌發生的關鍵因素，高危型HPV持續感染在宮頸癌及癌前病變發生發展中扮演重要角色[8]。宮頸癌患者HPV感染率較高，已被臨床廣泛重視，且隨著檢測技術的提高，HPV分型的篩查和診斷廣泛應用于臨床，為宮頸癌發生和進展機制的分析以及臨床治療提供了基礎理論和指導。

現國內外學者均證實，宮頸癌的發生與高危HPV感染密切相關，且尤以HPV 16型和HPV 18型感染為主[9-10]。研究顯示[11]，HPV 16型和HPV 18型占比約為78%，HPV 16型高于HPV 18型，多重感染約為13%。本研究結果顯示，120例合并高危HPV感染的宮頸癌患者中HPV 16型占比57.5%，HPV 18型占比30.83%，且多種感染率為10%，與上述研究數據基本一致。此外，本研究通過對不同病理類型宮頸癌進行對比分析結果顯示，宮頸腺癌的HPV 18亞型占比高于鱗癌，HPV 16亞型占比低于鱗癌，且宮頸腺癌的多重感染率高于鱗癌（P＜0.05），此差異可能影響患者病情進展與預后狀態。

國外學者Clifford等[12]報道宮頸鱗癌以HPV 16感染為主，而宮頸腺癌以HPV 18為主。張玲等[13]對我國52例宮頸腺癌HPV檢測顯示宮頸管型腺癌及子宮內膜樣腺癌中HPV l6/18的感染率均較高，在宮頸腺癌中HPV 16及HPV 18的感染率大致相當。本研究中宮頸腺癌以HPV 18亞型為主（64.71%），宮頸鱗癌以HPV 16亞型為主（62.79%），與Clifford等研究結論基本一致，此外，本研究中宮頸腺癌HPV 16亞型和HPV 18亞型感染率分別為41.18%和64.71%，與張玲研究中宮頸腺癌中HPV16及HPV18的感染率大致相當結論大致相符。現臨床證實，宮頸腺癌預后狀態較宮頸鱗癌差，相關機制尚未完全明確[14]，根據本研究HPV 16及HPV 18亞型分布可以推測HPV 18型感染不僅與腺癌的發生有關，可能影響病情的進展和預后。

E6和E7為HP基因早期區E中重要的非結構蛋白，在細胞永生化和惡性轉化中起到關鍵性作用，抑癌蛋白P53和磷酸化的Rb蛋白則是二者分別對應的接合位點，使后者失活引起細胞永生化，促進細胞的惡性進展[15-16]。E6蛋白結合P53并通過多種作用機制使P53失活，不僅抑制P53蛋白表達，并且引起細胞G1/S檢測點失活，使細胞周期失控，引起細胞永生化[17]。E7蛋白與Rb蛋白結合，激活轉錄因子E2F導致Rb-E2F復合體解離，使其凋亡作用減弱或喪失，促進惡性細胞的發生與發展[18]。本研究中120例宮頸癌患者E6、E7蛋白表達水平均較高，P53和Rb蛋白相對較低，對不同病理類型的宮頸癌患者進行對比分析發現，宮頸腺癌和宮頸鱗癌E6蛋白均呈高表達，但二者無顯著差異（P＞0.05）；而宮頸腺癌E7蛋白表達高于宮頸鱗癌，P53和Rb蛋白表達低于宮頸鱗癌，不同病理類型比較差異有統計學意義（P＜0.05）。P53和Rb蛋白表達與E6、E7蛋白表達水平呈負相關，E6、E7致癌蛋白分別與P53和Rb蛋白結合，導致二者含量和表達水平下調，且在宮頸腺癌中E7表達水平高于宮頸鱗癌，有研究顯示[19]，E7表達可明顯增加E6介導人端粒酶逆轉錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）轉錄能力，提示 E6 介導hTERT轉錄可能受到E7表達的限制和影響，而E7和hTERT在細胞永生化機制中具有協同作用。本研究Spearman相關性分析結果顯示，宮頸癌患者HPV 16亞型、HPV 18亞型與E6、E7、P53和Rb蛋白陽性表達均為正相關（P＜0.05），且宮頸癌患者HPV 16亞型和HPV 18亞型與E7相關性系數存在顯著差異（P＜0.05），表明E6和E7的高共表達率可能是宮頸腺癌預后不良的重要因素。

綜上所述，宮頸鱗癌高危HPV亞型以HPV 16型為主，宮頸腺癌高危HPV亞型以HPV 18型為主，且宮頸鱗癌和腺癌E7、P53和Rb蛋白陽性表達存在較大差異，宮頸腺癌較高多重感染率和E6、E7較高的共表達率可能是影響預后不良的重要因素，值得進一步研究探討。