Claudin-1、E-cad、CyclinD1和 nm23在不同分化肺腺癌中的表達及臨床意義

楊百路 李紫艷 張艷薇 謝 勇 曹 玓 柏青楊▲

1.齊齊哈爾醫學院基礎病理教研室，黑龍江齊齊哈爾 161000；2.內蒙古醫科大學第一臨床醫學院，內蒙古呼和浩特 010000

作為全球范圍內發病率及死亡率最高的腫瘤，肺癌居惡性腫瘤之首，嚴重影響人民的健康和生命。由于精準醫學的發展，盡管近年來肺癌的治療效果不斷提高，但5年生存率仍徘徊在15%左右。目前，靶向治療為肺癌治療研究的熱點。越來越多分子靶點的發現與靶向藥物的研發使肺癌的治療取得了很大進展[1-3]。精準的醫學模式是目前腫瘤治療的趨勢和方向，主要利用有效的分子生物標志物，區分目標人群，實行個體化治療。因此，探究肺癌的新有效分子生物學標志物與潛在治療靶點顯得尤為重要。隨著人類基因組計劃的完成，肺癌在基因層面上有了新的認識。基因分子水平認為肺鱗癌與肺腺癌是“兩種疾病”。有資料表明在肺腺癌可能更容易發現分子生物學標志物[4]。

Claudins是構成緊密連接的主要骨架蛋白，Claudins在多種腫瘤組織中表達水平明顯比周圍正常組織中高，并且腫瘤級別越高、淋巴結轉移越容易發生，表達水平越高[5-6]。E-鈣黏附素（E-Cadherin，E-cad）是黏附分子中鈣離子依賴的細胞黏附素家族，有抑制腫瘤轉移的作用，當E-cad表達降低或不表達，細胞間相互黏附力下降，更容易造成細胞分散并向外周浸潤性生長[7]。近年來的研究結果顯示，腫瘤轉移抑制基因23（non-metastatic 23，nm23）可以通過阻斷Wnt/β-catenin信號通路抑制腫瘤轉移[8]。CyclinD1是一類蛋白家族，與細胞周期有關，其表達水平隨著細胞周期變化，參與干細胞自我更新，促進細胞周期進程，能與基因特異性結合，調節多種基因表達，并且還能促進細胞增殖[9]。本實驗利用免疫組織化學染色的方法研究緊密連接蛋白-1（以下簡稱“Claudin-1”）、E-cad、nm23、CyclinD1在肺腺癌中的表達情況及與分化程度的關系，可為腫瘤的進展及潛在治療靶點的研究提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年3月至2017年3月齊齊哈爾醫學院臨床病理診斷中心收治的60例肺腺癌手術患者的癌組織和癌旁正常組織切除標本作為研究對象。患者手術前均未接受放、化療及其他抗腫瘤藥物治療。病理學分級：高分化腺癌18例，其中男6例，女12例；中分化腺癌32例，其中男12例，女20例；低分化腺癌10例，其中男4例，女6例。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，參與研究者知情同意。納入標準：①尚未接受治療的肺腺癌患者；②參與研究者知情同意。排除標準：①檢測結果為陰性；②其他組織類型的肺癌患者。

1.2 材料

Claudin-1、E-cad、nm23、CyclinD1 抗體[基因科技（上海）股份有限公司]，UltraSensitiveTM S-P超敏試劑盒 （鼠/兔）（福州邁新生物科技開發有限公司），二甲苯、乙醇、PBS液、過氧化氫液、蘇木素、蒸餾水、樹膠封片劑等，不銹鋼高壓鍋、顯微鏡、全自動石蠟包埋機、切片機。

1.3 方法

1.3.1 石蠟切片制作 每例切片5～6張，厚度5 μm，撈片于防脫載玻片，置于37℃溫箱烘干。

1.3.2 HE染色 選取每例石蠟切片1張，進行蘇木素-伊紅染色。

1.3.3 免疫組織化學染色采用ABC法進行Claudin-1、E-cad、CyclinD1和 nm23染色。

1.4 觀察指標及評價標準

Claudin-1在細胞膜和胞質陽性表達，E-cad在胞膜陽性表達，nm23在胞質陽性表達，CyclinD1在胞核陽性表達。陽性結果判定標準：腫瘤細胞的胞膜、胞質或胞核呈黃色至棕褐色為陽性染色。高倍鏡下隨機選取10個視野，結合染色強度和陽性細胞數量進行判定[10]。染色強度按切片中細胞著色的深淺評分：細胞無顯色為0分；黃色為1分；2分為棕黃色；3分為棕褐色。陽性細胞數量按陽性細胞數占同類細胞數的百分比評分：0%～＜5%為0分；5%～＜25%為1分；25%～＜50%為2分；50%～＜75%為3分；75%以上為4分。上述兩項評分的乘積作為總積分：0分為陰性（-）；1～4分為弱陽性（+）；5～8 分為中等程度陽性（2+）；≥9分為強陽性（3+）。

1.5 統計學方法

采用SPSS 25.0統計學軟件進行數據分析，計數資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 組織學檢查結果

顯微鏡下觀察HE染色切片用于檢測病理診斷結果，根據鏡下腺癌形態判斷分化程度：貼壁型為高分化18例，腺泡型、乳頭型為中分化32例，微乳頭型、實性型為低分化10例。

2.2 免疫組化染色結果

實驗組的E-cad、nm23的表達低于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）；實驗組的 CyclinD1、Claudin-1的高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）；高、中分化腺癌中E-cad、nm23的表達高于低分化，差異有統計學意義（P<0.05）。高、中分化腺癌中CyclinD1、Claudin-1的表達低于低分化，差異有統計學意義（P<0.05）（表 1；圖 1，封三）。

圖 1 Claudin-1、E-cad、nm23、Cyclin D1 在肺腺癌中的表達（IHC 染色，200×）（見內文第 39頁）

3 討論

細胞黏附既能維持組織結構穩定，也能調節細胞運動和發揮功能，并對細胞增殖、分化有重要影響。黏附、降解和移動是腫瘤發生侵襲的三步曲，同時腫瘤細胞向周圍組織侵襲和轉移必須穿過細胞外的基質屏障、血管壁基底膜才能進入宿主微循環。

細胞的黏附結構以Claudins最重要，其改變可以影響緊密連接的結構和功能。這種改變可以是Claudins數量上改變，也可以是基因突變。E-cad是介導鈣依賴性上皮細胞黏附的最主要分子，介導同種細胞間連接，使得腫瘤細胞保持密切聯系從而難以脫離原發灶。E-cad蛋白的功能或表達缺失時，腫瘤細胞間的黏附作用減弱從而獲得侵襲能力。目前腫瘤組織中Claudins的過表達機制正在研究中，研究結直腸癌組織Claudin-1的過表達機制時發現，Claudin-1的過表達可以抑制E-cad表達，失去E-cad表達使E-cad/Tcf信號通路上調。Claudin-1在細胞膜上定位改變、E-cad表達減少、E-cad/Tcf信號通路上調共同作用促進腫瘤發生發展。有研究發現Claudin-1在人類原發性結腸癌中表達上調，抑制Claudin-1的表達后可增加E-cad的轉錄，從而提示Claudin-1可促進細胞轉化、腫瘤生長和轉移[11]。有研究發現Claudin-1在肺腺癌中的陽性表達與預后差有關[12-14]。本研究結果顯示，高、中分化腺癌中E-cad、nm23的表達高于低分化，差異有統計學意義（P<0.05）。高、中分化腺癌中CyclinD1、Claudin-1的表達低于低分化，差異有統計學意義（P<0.05）。E-cad在肺腺癌表達降低，在高中分化肺腺癌與低分化肺腺癌的表達比較，差異有統計學意義（P<0.05）。nm23基因是腫瘤細胞重要轉移抑制基因，對癌細胞的運動與轉移有明顯抑制作用，主要通過參與G蛋白調控跨膜信息傳遞，從而對細胞分化及癌基因轉化起作用，其表達高低與腫瘤病理學分級和淋巴結轉移能力相關[15]。CyclinD1在肺癌的發生發展中起關鍵作用[16]，可作為判斷腫瘤分化程度的指標，可能在肺癌發生過程中較早發生，具有早期診斷價值[17]。在肺腺癌組織，Claudin-1、CyclinD1的表達增高，從高分化到低分化，其過表達率均呈上升趨勢，而E-cad、nm23的表達率均呈降低趨勢。Claudin-1、CyclinD1、E-cad與nm23可能參與了正常細胞的生長發育及肺腺癌的發生發展。

綜上所述，Claudin-1、E-cad、nm23、CyclinD1 在腫瘤的發生、發展中相互拮抗，從而影響腫瘤的演進，可作為組織學分型、臨床分期和預后判斷的輔助指標。可行性較高，值得在基層醫院推廣。