lncRNA Gm4419靶向miR-703對Aβ25-35誘導的PC12細胞氧化應激和凋亡的影響

楊慶華 楊隆良 楊曉莉

阿爾茨海默病(AD)是一種常見于老年人的復雜中樞神經系統的慢性退行性疾病，表現為記憶喪失、認知和行為功能的永久性損害以及各種精神障礙，是導致老年人癡呆的主要原因。隨著全球人口老齡化發展，AD發病率逐年增加，已成為一種普遍的健康問題[1]。由于對AD發生、進展機制認識有限，目前臨床仍缺乏有效方法來阻止或延緩疾病進展。長鏈非編碼RNA(lncRNA)作為表達遺傳調控分子通過染色質修飾、轉錄調控等多種方式發揮生物活性，參與調控細胞存活、凋亡、氧化應激、炎性反應等多種病理生理過程，在包括AD在內的等多種神經退行性疾病發揮作用[2,3]。研究顯示lncRNA Gm4419在糖尿病腎病中表達上調，敲低其表達可抑制炎性反應[4]。Gm4419通過激活NF-κB信號上調趨化素表達誘導神經細胞凋亡進而促進高血壓性腦動脈硬化惡化[5]。然而Gm4419在AD進展中的作用和分子機制并不清楚。miR-703是一種心肌梗死保護性miRNA，研究顯示miR-703通過抑制心肌細胞焦亡保護缺氧復氧誘導的心肌細胞損傷[6]。序列分析發現miR-703是Gm4419的潛在靶基因，但Gm4419是否靶向miR-703參與AD進展尚未有研究。β-淀粉樣肽25-35(Aβ25-35)是一種短分子片段，具有全長肽的毒性，其誘導的PC12細胞損傷在AD體外研究中已廣泛應用[7,8]。因此，本研究重點探討Gm4419和miR-703對Aβ25-35誘導的PC12細胞氧化應激和細胞凋亡的影響，分析二者靶向調控關系，以期為防治AD提供有效靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 大鼠嗜鉻細胞瘤細胞PC12購于中國科學院上海細胞庫；Aβ25-35(取適量Aβ25-35溶于無菌三蒸水中制成1 mmol/L儲存液，-20℃冰箱避光保存備用)購于上海樊克生物科技有限公司；逆轉錄酶、SYBR green master mix購于大連寶生物公司；小干擾RNA(si-RNA)、miRNA模擬物(mimics)、miRNA抑制物(anti-miR)、過表達載體(pcDNA-RNA)由廣州復能基因公司提供；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)試劑盒購于北京博奧森生物；兔源B細胞淋巴瘤(Bcl-2)抗體、兔源Bcl相關x蛋白(Bax)抗體、兔源磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體購于上海碧云天生物公司；超氧化物歧化酶(SOD)活性測定試劑盒、丙二醛(MDA)含量測定試劑盒購于北京索萊寶生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養:復蘇PC12細胞后，將其接種在含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素溶液的DMEM培養基中置于37℃、含5%CO2的培養箱中培養。每2～3天更換1次培養液，取對數生長期的細胞進行后續實驗。實驗前1 d用含50 μg/L的神經生長因子誘導PC12分化使其具有神經細胞特性。

1.2.2 實驗分組:對照組(Con組)為未經任何處理的PC12細胞；Aβ25-35組為用含40 μmol/L培養液孵育PC12細胞48 h[9]；Aβ25-35+si-NC組、Aβ25-35+si-Gm4419組、Aβ25-35+miR-NC組、Aβ25-35+miR-703組為將si-NC、si-Gm4419、miR-NC、miR-703 mimics分別轉染PC12細胞后，用含40 μmol/L Aβ25-35培養液孵育細胞48 h；Aβ25-35+si-Gm4419+anti-miR-NC組、Aβ25-35+si-Gm4419+anti-miR-703組為將si-Gm4419+anti-miR-NC、si-Gm4419+anti-miR-703分別轉染PC12細胞后，用含40 μmol/L Aβ25-35培養液孵育細胞48 h。細胞轉染為采用脂質體Lipofectamine 2000進行瞬時轉染，收集轉染48 h細胞進行Aβ25-35處理。

1.2.3 實時定量PCR(RT-qPCR)分析Gm4419和miR-703表達量:按照Trizol試劑使用說明書提取各組PC12細胞總RNA，分光光度計法測定其濃度后置于-80℃冰箱保存。利用逆轉錄酶將RNA反轉錄為cDNA，再利用SYBR green master mix進行RT-qPCR。Gm4419和miR-703表達量以2-ΔΔCT法計算。Gm4419上游引物5’-GGAACCA AGCAGACCGAAGAC-3’，下游引物5’-CCC CAACCCACAGGAACATAA-3’；內參GAPDH上游引物5’-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3’，下游引物5’-GAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3’。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡:收獲各組PC12細胞，磷酸鹽緩沖液洗滌后重懸于500 μl結合緩沖液中，分別加入加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl的PI，混勻后暗室孵育15 min，流式細胞儀分析細胞凋亡。

1.2.5 蛋白質印記法(western blot)檢測Bcl-2和Bax蛋白表達量:放射免疫沉淀試驗(RIPA)緩沖液提取各組PC12細胞總蛋白。蛋白定量后，將適量蛋白與等體積上樣緩沖液混合煮沸3 min變性，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后，濕轉法將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜上。膜封閉后，4℃下用抗Bcl-2抗體、抗Bax抗體孵育膜過夜。室溫下再用二抗孵育膜2 h。化學發光法顯影、定影，曝光后，采用Image J軟件分析各條帶灰度值，目的蛋白表達量以對應蛋白和內參GAPDH灰度值比值表示。

1.2.6 ELISA試劑盒檢測SOD活性、MDA含量:收集各組PC12細胞至離心管內，離心(1 000 g)10 min棄上清液，加入提取液超聲破碎細胞，4℃下離心(8 000 g)10 min獲得上清液，置于冰上備用。隨后按照試劑盒步驟測定SOD活性以及MDA含量。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因實驗:將含有miR-703結合位點序列的Gm4419野生序列或Gm4419突變序列分別克隆到熒光素酶報告質粒構建野生型或突變型熒光素酶報告載體WT-Gm4419或MUT-Gm4419。將WT-Gm4419、MUT-Gm4419分別與miR-703 mimics、miR-NC共轉染PC12細胞，在轉染48 h時裂解細胞并檢測熒光素酶活性。同時將pcDNA、pcDNA-Gm4419、si-NC、si-Gm4419分別轉染PC12細胞，RT-qPCR檢測細胞中miR-703表達量。

2 結果

2.1 lncRNA Gm4419和miR-703在Aβ25-35誘導的PC12細胞損傷中的表達 Aβ25-35組PC12細胞Gm4419表達量顯著高于Con組(P<0.05)，miR-703表達量顯著低于Con組(P<0.05)。見表1。

表1 lncRNA Gm4419和miR-703在Aβ25-35誘導的PC12細胞損傷中的表達

2.2 抑制lncRNA Gm4419表達對Aβ25-35誘導的PC12細胞氧化應激和細胞凋亡的影響 與Con組比較，Aβ25-35組PC12細胞Gm4419表達量、凋亡率、Bax蛋白表達量、MDA含量顯著升高(P<0.05)，SOD活性、Bcl-2蛋白表達量顯著降低(P<0.05)；與Aβ25-35+si-NC組比較，Aβ25-35+si-Gm4419組PC12細胞Gm4419表達量、凋亡率、Bax蛋白表達量、MDA含量顯著降低(P<0.05)，SOD活性、Bcl-2蛋白表達量顯著升高(P<0.05)。見圖1，表2。

圖1 抑制lncRNA Gm4419表達對Aβ25-35誘導的PC12細胞凋亡的影響;A 凋亡相關蛋白表達；B 細胞凋亡流式圖

表2 抑制lncRNA Gm4419表達對Aβ25-35誘導的PC12細胞氧化應激和細胞凋亡的影響

2.3 miR-703過表達對Aβ25-35誘導的PC12細胞氧化應激和細胞凋亡的影響 與Aβ25-35+miR-NC組比較，Aβ25-35+miR-703組PC12細胞miR-703表達量、SOD活性、Bcl-2蛋白表達量顯著升高(P<0.05)，凋亡率、Bax蛋白表達量、MDA含量顯著降低(P<0.05)。見圖2，表3。

圖2 miR-703過表達對Aβ25-35誘導的PC12細胞氧化應激和細胞凋亡的影響;A 凋亡相關蛋白表達；B 細胞凋亡流式圖

表3 miR-703過表達對Aβ25-35誘導的PC12細胞氧化應激和細胞凋亡的影響

2.4 lncRNA Gm4419靶向調控miR-703的表達 LncBase Predicted v.2在線分析顯示Gm4419與miR-703存在特異性結合位點。miR-703 mimics和WT-Gm4419共轉染后細胞熒光素酶活性較miR-NC和WT-Gm4419共轉染顯著降低(P<0.05)，而miR-703 mimics和MUT-Gm4419共轉染后細胞熒光素酶活性與miR-NC和MUT-Gm4419共轉染比較無顯著變化。pcDNA-Gm4419組細胞中miR-703表達量較pcDNA組顯著降低(P<0.05)，而si-Gm4419組細胞中miR-703表達量較si-NC組顯著升高(P<0.05)。見表4、5，圖3。

表4 雙熒光素酶報告實驗

2.5 抑制miR-703表達逆轉了lncRNA Gm4419抑制

表5 lncRNA Gm4419調控miR-703的表達

圖3 lncRNA Gm4419的序列中含有與miR-703互補的核苷酸序列

對Aβ25-35誘導的PC12細胞氧化應激和細胞凋亡的作用 與Aβ25-35+si-Gm4419+anti-miR-NC組比較，Aβ25-35+si-Gm4419+ anti-miR-703組PC12細胞miR-703表達量、SOD活性、Bcl-2蛋白表達量顯著降低(P<0.05)，凋亡率、Bax蛋白表達量、MDA含量顯著升高(P<0.05)。見表6，圖4。

表6 干擾miR-703表達逆轉了抑制lncRNA Gm4419表達對Aβ25-35誘導的PC12細胞氧化應激和細胞凋亡的作用

圖4 干擾miR-703表達逆轉了抑制lncRNA Gm4419表達對Aβ25-35誘導的PC12細胞凋亡的作用；A 凋亡相關蛋白表達；B 細胞凋亡流式圖

3 討論

AD可導致神經元損傷和大腦認知能力退化，是老年癡呆癥發生的最主要原因。近年來。多項研究證實lncRNA參與了AD相關病理過程。如lncRNA核富含豐富的轉錄本1(NEAT1)在Aβ25-35誘導的神經元細胞中表達增加，下調其表達減弱Aβ25-35對細胞活力的抑制作用，并促進神經元凋亡、增加Tau蛋白磷酸化水平[10]。上調lncRNA母系表達基因3(MEG3)可改善AD大鼠認知障礙，減輕神經損傷，抑制星形膠質細胞的激活和炎性反應[11]。本研究中Aβ25-35誘導的PC12損傷后Gm4419表達水平升高提示Gm4419表達改變可能與AD患者神經元損傷。轉染si-Gm4419進行功能驗證發現，抑制Gm4419表達顯著減弱Aβ25-35誘導的PC12細胞凋亡。與本研究發現類似，抑制Gm4419表達可抑制缺氧復氧誘導的肝或心肌細胞凋亡保護肝或心肌缺血再灌注損傷[12,13]。Bcl-2和Bax蛋白是線粒體凋亡途徑的作用調節因子，Bax移位導致線粒體通透性增加促進細胞色素c等蛋白釋放進而啟動caspase依賴性凋亡發生，Bcl-2通過與Bax結合具有抗凋亡作用[14]。本研究中抑制Gm4419表達顯著降低Aβ25-35誘導的PC12細胞中Bax蛋白水平，升高Bcl-2表達水平，與其抗凋亡作用一致。氧化應激是神經退行性疾病發生的始動因素，其可促進Aβ沉積、tau蛋白過度磷酸化以及隨后突觸和神經元的丟失，直接參與AD發生和進展[15]。MDA是脂質過氧化的終產物，通過檢測細胞中MDA水平可有效反應細胞氧化損傷程度[16]。本研究中發現抑制Gm4419表達顯著降低Aβ25-35誘導的PC12細胞中MDA含量，并提高SOD活性。以上研究提示抑制Gm4419表表達可減輕Aβ25-35誘導的PC12細胞凋亡和氧化應激損傷。

大量研究表明lncRNA通過與miRNA相互作用抑制miRNA活性是其發揮生物學功能的重要機制。如沉默lncRNA牛磺酸上調基因1(TUG1)通過上調miR-15a表達可改善AD小鼠的空間學習、記憶能力，改善病理損傷，增強海馬神經元抗氧化能力，抑制神經元凋亡[17]。lncRNA肺腺癌轉移相關轉錄本1(MALAT1)通過靶向miR-125b顯著抑制神經元凋亡、神經炎癥，刺激神經突生長[18]。本研究發現Aβ25-35誘導的PC12損傷后miR-703表達降低，進一步研究證實miR-703是Gm4419的靶基因，且過表達或抑制Gm4419分別下調或上調miR-703表達水平。轉染miR-703進行功能分析發現過表達miR-703顯著抑制Aβ25-35誘導的PC12細胞凋亡和氧化應激損傷，與抑制Gm4419表達的保護作用一致。進一步恢復實驗顯示，抑制miR-703表達顯著減弱Gm4419抑制對Aβ25-35誘導的PC12細胞和氧化應激損傷的保護作用，這進一步說明Gm4419可能通過靶向負調控miR-703表達參與Aβ25-35誘導的PC12細胞損傷。但本研究仍限于體外研究，后續將在動物模型中進一步確定lncRNA Gm4419/miR-703分子軸在Aβ25-35誘導PC12細胞損傷中的作用。

總之，本研究證實抑制lncRNA Gm4419通過上調miR-703表達能夠減輕Aβ25-35誘導的PC12細胞凋亡和氧化應激損傷，這為靶向lncRNA Gm4419/miR-703分子軸防治AD奠定理論基礎。