一株燕麥根腐病生防菌的鑒定及其防治效果

張建強，吳康莉，張曉夢，李昭煜,，李佳佳，漆永紅，田永強,

（1. 蘭州交通大學化學與生物工程學院，甘肅 蘭州 730070；2. 蘭州交通大學研究院甘肅省植物源生物農藥工程技術研究中心，甘肅 蘭州 730070；3. 甘肅省農業科學院植物保護研究所，甘肅 蘭州 730070）

燕麥(Avena sativa)是禾本科燕麥屬的一年生植物，是世界上糧飼兼用的重要農作物之一，多生長在高寒、貧瘠和干旱的極端環境中，抗逆性較強，已經成為寒旱地區不可替代的特色糧飼作物[1]，在世界上被廣泛種植，種植面積約1 400 萬hm2，總產量2 800 萬t[2-3]。燕麥富含蛋白質、不飽和脂肪酸、維生素和礦物質等各種營養物質，具有降血脂、調節血糖和預防便秘等多種保健功能。燕麥莖葉飼用營養價值高，適口性好，是農牧區冬春補飼和抗災保畜的優良飼草。

隨著近年來燕麥種植面積不斷擴大，水肥條件的改善和氣候變暖的影響，導致燕麥病害問題日益嚴重，在燕麥種植區普遍發生[1,4-5]，嚴重影響燕麥的品質和產量。燕麥的病害按照病原菌的侵染部位可以分為葉部病害、根部及莖基部病害、穗部病害。其中，常見的葉部病害的病原菌主要包括燕麥內臍蠕孢(Drechslera avenae)、 禾布氏白粉菌(Blumeria graminis)、燕麥冠銹菌(Puccinia coronata)和核腔菌(Pyrenophora avenicola)[6]；根部病害的病原菌主要包括燕麥鐮刀菌(Fusarium avenaceum)、假禾谷鐮刀菌(F. pseudograminearum)[7]和立枯絲核菌(Rhizoctoia solani)；穗部病害的病原菌主要包括燕麥散黑粉菌(Ustilago avenae)、黑粉菌(U. segetum)、層出鐮刀菌(F. proliferatum)[8-9]和雪霉微座孢(Microdochium nivale)[10-11]。

為防治因病蟲害造成的損失，大量使用化學農藥造成了燕麥相關產品的農藥殘留，也對牧區草地生態環境造成嚴重污染，威脅著草原畜牧業生產和人類的健康。因此，利用微生物菌劑開展生物防治是預防植物病蟲害和解決化學農藥污染的最理想途徑。查閱國內外文獻發現，對燕麥根部病害的調查研究較多，且防治藥劑主要以化學農藥為主，關于生物防治的研究鮮有報道[12]。為此，通過從健康燕麥田土壤中分離出一株對燕麥根腐病菌具有防治作用的拮抗細菌，旨在為燕麥根腐病的生防菌開發和綠色防控提供新的依據和思路。

1 材料與方法

1.1 供試病原菌

燕麥鐮孢菌(F. avenaceum)、茄腐鐮孢菌(F.solani)、番茄匍柄霉(Stemphylium lycopersici)、立枯絲核菌(R. solani)、禾谷鐮孢菌(F. graminearum)、細極鏈格孢(Alternaria tenuissima)、番茄灰霉(Botrytis cinerea)、核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)、尖孢鐮孢菌(F. oxysporum)。以上菌株由蘭州交通大學微生物實驗室分離、保存。

1.2 土樣采集

2020 年6 月，在甘肅省合作市卡加曼鄉香拉村燕麥地(35°06′22.20″ N, 102°52′6.02″ E)，用“S”型采樣法選取健康燕麥植株，土壤樣品的采集采用抖根法，先鏟去植株根際表層0 ? 5 cm 的土壤，取5 ?20 cm 附著于根毛上的土壤裝入無菌自封袋帶回實驗室，4 ℃保存，用于后續試驗。

1.3 培養基制作

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar, PDA)培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 L；馬鈴薯葡萄糖(potato dextrose broth, PDB)培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，水1 L。

1.4 拮抗菌的篩選

將土壤樣品稱取1 g，用100 mL 無菌水配置成懸液，然后將懸液梯度稀釋，采用平板涂布法吸取100 μL 濃度1×10?5的懸液均勻涂布于PDA 培養基上，28 ℃培養3 d，挑取形態各異的菌落劃線純培養。試驗重復3 次。

采用平板對峙培養法進行篩選，將培養5 d 的燕麥根腐病菌用打孔器(直徑6 mm)打成菌餅接種于培養皿中央，再用接種環將培養24 h 的細菌用十字交叉法接種在距菌餅2 cm 處，25 ℃黑暗培養5 d。能產生抑菌帶即為拮抗菌，并測定抑菌率[13]。抑菌率 = (對照組菌落直徑 ? 處理組菌落直徑)/對照組菌落直經 × 100% 。試驗重復3 次。

1.5 拮抗菌抑菌廣譜性測定

為測定拮抗菌潛在應用價值，測定其對8 種常見農作物病原菌的抑菌能力。方法同上。供試病原菌：茄腐鐮孢菌、番茄匍柄霉、立枯絲核菌、禾谷鐮孢菌、細極鏈格孢、番茄灰霉孢、核盤菌、尖孢鐮孢菌。

1.6 拮抗菌鑒定

采用Ezup 柱式細菌基因組DNA 抽提試劑盒(上海生工生物工程有限公司)提取拮抗菌總DNA 后，通過測序分析其16S rDNA 基因序列進行拮抗菌鑒定。采用細菌通用引物27F (5-AGAGTTTGATCTGG CTCG-3)和1492R (5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3)聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)擴增16S rDNA。PCR 的反應體系為25 μL，所用程序為94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，共進行30 次循環，然后以72 ℃延伸10 min 后，4 ℃保存備用。送至北京華大基因完成測序工作，測序結果在NCBI 數據庫Blast 比對分析，并用MEGA 6.0 軟件選擇最大似然法(maximum likelihood, ML)構建系統發育樹。

1.7 拮抗菌抑菌能力測定

1.7.1 菌株YF 發酵液對燕麥鐮孢菌菌絲的抑制作用

從活化的燕麥鐮孢菌培養皿中取5 個直徑為8 mm 的菌餅，接種于100 mL PDB 培養基中，28 ℃、180 r·min?1培養24 h 后加入1 mL 培養24 h 的YF 發酵液(無菌)，對照組不接種YF 發酵液。繼續培養2 d 后在光學顯微鏡下觀察各組燕麥鐮孢菌菌絲的生長情況。

1.7.2 菌株YF 對燕麥鐮孢菌孢子萌發的抑制作用

采用瓊脂培養法[14]，并做一些改進。在潔凈無菌的載玻片上滴加含有無菌YF 發酵液的1.5%水瓊脂培養基，待水瓊脂凝成薄層后，將有瓊脂培養基的一面朝上，平放在培養皿中“U”形玻璃棒上，再吸取10 μL 孢子濃度為1.5 × 105個·mL?1的燕麥鐮孢菌分生孢子懸浮液均勻涂抹在水瓊脂平面上，平板底部加浸水的濾紙片保溫培養，置于25 ℃培養箱中培養，每個處理重復3 次。以不加發酵液的水瓊脂為空白對照。24 h 后在光學顯微鏡下觀察，每次鏡檢50 個孢子，并統計萌發率 。萌發抑制率 =(對照組萌發率 ? 處理組萌發率) / 對照組萌發率 ×100%[15]。

1.7.3 菌株YF 防效測定

將培養8 d 的燕麥鐮孢菌加5 mL 無菌水，輕輕刮下孢子，置于無菌三角瓶中稀釋成孢子濃度為1.5 × 103個·mL?1的孢子懸浮液，每盆取100 mL 孢子懸浮液與滅菌土(約1 kg)拌勻后裝盆，選取顆粒飽滿的燕麥種子，用75%的乙醇消毒后分裝于花盆中，每盆10 粒，覆土1 cm 左右后置于光照培養箱中培養。試驗設置3 個處理，分別為處理組[待燕麥出苗后，將YF 制成菌懸液(1 × 108cfu·mL?1) 20 mL進行灌根處理]、對照組[待燕麥出苗后，以50%多菌靈粉劑為常規對照(稀釋倍數為800 倍)，取稀釋后的多菌靈溶液20 mL 進行灌根處理]和空白對照組(以20 mL 無菌水進行灌根處理)。每個處理重復3 次。灌根15 d 后調查各處理病害發生情況，用自來水將根莖部土壤沖洗干凈后，觀察記載發病程度，然后統計發病率并計算病情指數和防治效果。根腐病病情調查分級標準[16]：0 級，根部無病斑；1 級，根部出現淡褐色斑點，根系發病面積占1%～15%；3 級，部分根部變褐色至黑褐色，根系發病面積占16%～30%；5 級，多數根部變黑褐色，根系發病面積占31%～60%；7 級，根部變黑甚至腐爛，根系發病面積占60%以上。計算公式[17]：

1.8 數據統計

利用Excel 2016 和SPSS 22.0 進行統計分析，以平均值 ± 標準差表示，采用單因素方差分析菌落直徑，采用Duncan 法進行多重比較，顯著水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 拮抗菌的分離和篩選

以燕麥鐮孢菌為靶點，利用平板對峙培養法篩選拮抗細菌。通過篩選獲得一株抑制效果較好的菌株YF，抑菌效果明顯(圖1)，經測定處理菌落直徑為(1.7 ± 0.3) cm，對照菌落直徑為(5.8 ± 0.4) cm，抑制率為70.69%。因此，確定以菌株YF 為燕麥鐮孢菌拮抗菌株開展后續研究。

圖1 菌株YF 對燕麥鐮孢菌的抑制效果Figure 1 Inhibitory effect of strain YF on Fusarium avenaceum

2.2 拮抗菌的抑菌廣譜性測定

采用平板對峙培養法測定了拮抗菌YF 對8 種常見植物病原菌的抑菌作用。結果表明YF 對供試病原菌均表現出較好的抑菌作用(表1)。其中YF 對茄腐鐮孢菌、番茄匍柄霉、立枯絲核菌、禾谷鐮孢菌、細極鏈格孢、番茄灰霉孢、核盤菌均具有較強的抑菌作用，抑菌率達到70%以上，對尖孢鐮刀菌為中度拮抗作用，抑菌率為62.23%。

表1 菌株YF 抑菌廣譜性測定Table 1 Determination of broad spectrum antimicrobial activity of strain YF

2.3 拮抗菌株YF 的鑒定

菌株YF 在PDA 培養基上菌落為圓形，突起，乳白色，粘稠狀，不透明，表面濕潤光滑，邊緣不整齊，具有很強的粘性(圖2A)；經革蘭氏染色觀察，該菌為革蘭氏染色陽性，菌體桿狀，大小為(0.5～2.5) μm × (1.2～8) μm (圖2B)。利用16S rDNA 基因進行PCR 擴增分析，結合最大似然法建樹進行鑒定。結果顯示，菌株YF (GenBank 登錄號：MW205750)與多粘類芽孢桿菌[Paenibacillus polymyxaATCC:25901 (KM051087.1)]聚集在一起(圖3)。因此，基于以上研究結果可以確定菌株YF 為多粘類芽孢桿菌。

圖2 菌株YF 形態Figure 2 Morphology of strain YF

圖3 基于16S rDNA 基因系統發育樹Figure 3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene

2.4 菌株YF 發酵液對燕麥鐮孢菌菌絲和孢子萌發的抑制作用

利用菌株YF 無菌發酵濾液處理燕麥鐮孢菌后通過顯微鏡觀察發現，燕麥鐮孢菌菌絲生長明顯受到YF 發酵濾液的影響(圖4)。與對照組相比，處理組的燕麥鐮孢菌菌絲膨大變粗，分枝增多，節間縮小，出現囊泡狀畸形。采用瓊脂培養法研究了該菌發酵液對燕麥鐮孢菌孢子萌發的影響，結果表明，對照組萌發率為90.00%，處理組萌發率為12.67%，經計算，該菌對燕麥鐮孢菌孢子萌發的抑制率為85.92% (表2)。

表2 孢子萌發抑制率Table 2 Rate of inhibition of spore germination

圖4 菌株YF 對燕麥鐮刀菌的抑制作用Figure 4 Inhibition of Fusarium avenaceum by strain YF

2.5 菌株YF 防效測定

為驗證菌株YF 在田間對燕麥鐮孢菌的作用效果，模擬田間開展了室內盆栽防效試驗。從農藝性狀來看，不同處理組的盆栽燕麥在出苗15 d 后表現出明顯差異，其中多粘類芽孢桿菌處理組燕麥長勢良好，根系發達，株高和根長與其他處理組間存在明顯差異(表3)，多菌靈處理組次之，空白對照組燕麥明顯長勢較弱，根系較少，并且根部變褐色(圖5)。統計分析發現，多粘類芽孢桿菌處理組的發病率、病情指數、防治效果均與多菌靈處理和空白對照差異顯著(P< 0.05)，其防治效果高達81.45%，明顯優于多菌靈處理組的61.87%。

圖5 菌株YF 對燕麥生長的影響Figure 5 Effect of strain YF on oat growth

表3 菌株YF 在燕麥上的防治效果Table 3 Control effect of strain YF on oat

3 討論與結論

我國燕麥主產區主要分布在內蒙古、青海、陜西、山西、吉林、甘肅[18]，燕麥產區各種病害的發生已經引起了重視，尤其對葉部病害的調查研究較多，但是對于燕麥根腐病的研究報道相對較少。根據《中國牧草真菌病害名錄》[19]記載，能夠引起燕麥根腐病的病原菌有燕麥鐮孢菌、大刀鐮孢菌(F.culmorum)、禾谷鐮孢菌、雪腐鐮孢菌(F. nivale)、長直喙鐮孢菌(F. orthoceras)、早熟禾鐮孢菌(F. poae)、藤草鐮孢菌(F. scripi)，并且病害分布不詳。馬從[20]對甘肅省燕麥病害調查發現根腐病病原菌為小麥長蠕孢菌(Helminthosporium tritici-repetis)。陳昊[5]通過對甘肅省燕麥真菌病害多樣性調查發現，燕麥根腐病病原菌為燕麥鐮孢菌、層出鐮孢菌(F.proliferatum)、雪球微座孢(M. nivale)，其中燕麥鐮孢菌的分離頻率最高，在通渭、山丹、天祝和榆中4 個地區分離率分別達到31%、30%、58%和44%，燕麥根部病害在各地發生差異較大，山丹地區相比于其他調查地區發病率最高，青引1 號燕麥品種的發病率達到2.93%，而在通渭地區根部病害發生最輕，定引1 號發病率為0.02%，在天祝、榆中地區不同品種的發病率不同，但總體發病率較低。

關于燕麥根腐病防治研究大多數是化學防治，生物防治文獻極少，僅有陳昊[5]和馬從[20]分別研究報道菌株Y-Y-1 與菌株LHS11 對燕麥根腐病病原菌有抑制作用，但抑菌效果并不理想，抑菌率分別為3.09%與41.2%。為了燕麥種植業的健康發展，急需開展該領域的綠色生物防治研究。本研究從甘肅合作市卡加曼鄉香拉村燕麥根際土壤中分離到一株生防菌YF，經鑒定為多粘類芽孢桿菌，室內活性測定發現該菌不僅對燕麥鐮孢菌具有較好的抑制作用，對孢子萌發抑制作用也達到85.92%。通過盆栽試驗發現菌株YF 對燕麥根腐病的防治效果達到81.45%，防效顯著高于化學農藥多菌靈(61.87%)，并且對燕麥促生長作用明顯。因此，多粘類芽孢桿菌YF 具備開發為燕麥根腐病生物防治菌劑的潛力。

多粘類芽孢桿菌是目前農業生產中應用較為廣泛的生物菌劑。可用于多種真菌、細菌和線蟲引起的病害防治。據文獻報道，多粘類芽孢桿菌XZ-2 發酵原液10 倍稀釋液對甘薯(Dioscorea esculenta)黑斑病的防治效果最佳，達到73.62%，并且顯著地抑制其分生孢子的萌發[21]。劉珂欣等[22]研究表明，多粘類芽孢桿菌CH-23 菌劑對水稻(Oryza sativa)惡苗病具有較好的生防效果，生防指數高達68.35%。孫光忠等[23]研究表明，5 億cfu·g?1多粘類芽孢桿菌懸浮劑對小麥(Triticum aestivum)赤霉病防治效果在80%以上，增產效果達到14.51%～17.27%，說明多粘類芽孢桿菌可以廣泛用于小麥赤霉病的防治。多粘類芽抱桿菌已作為微生物殺菌劑產品進行登記，在美國登記的商品名為Hydroguard，在韓國登記的商品名為Topseed 和NH[24]，說明多粘類芽孢桿菌具備廣譜的抗菌活性。

本研究所篩選出的拮抗菌株YF 從室內活性測定和盆栽試驗證明其對燕麥鐮孢菌有較好的防治效果，但還需要研究菌株YF 針對燕麥鐮孢菌作用的主要代謝產物及作用分子機理，闡明其作用機制，并進一步開展田間試驗驗證，有望早日將該菌開發為用于防治燕麥鐮孢菌的生物防治菌劑。本研究結果可為燕麥根腐病病原菌燕麥鐮孢菌的生物防治和相應產品的開發提供新的思路和途徑。