添加不同生物益生菌對木薯塊根青貯品質和微生物菌群多樣性的影響

潘佳慧，喻 珊，蔡 杰，李開綿，歐文軍，王志勇

（1. 熱帶特色林木花卉遺傳與種質創新教育部重點實驗室 / 海南大學林學院 熱帶作物學院，海南 海口 570228；2. 中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所，海南 ?？?571101）

木薯(Manihot esculenta)為大戟科木薯屬植物，其塊根富含淀粉且產量較高、價格低廉，可代替玉米(Zea mays)等能量飼料，在我國南方可作為地源性飼料進行綜合利用[1]。但鮮木薯塊不易保存且含有有害物質氫氰酸，不能直接供動物大量采食。青貯作為一種不消耗能量且能最大限度保存飼料營養的一種低成本處理方法，能夠有效去除氫氰酸[2-3]，同時青貯可以分解大分子蛋白質及難消化的纖維類物質，提高消化利用率，改善飼料適口性并延長保存時間[4-5]，而添加優良的菌種則是提高青貯品質和縮短青貯時間的關鍵[6-7]。

微生物在青貯過程中發揮了重要作用，其菌群群落構成及豐度變化直接影響到青貯品質，同時青貯品質也受到添加菌劑類型、環境條件等因素的影響[8-9]。因此，研究添加生物益生菌對木薯塊根青貯后微生物多樣性的影響具有重要意義。目前有關木薯青貯的研究主要集中在木薯莖葉[10-12]、木薯渣[13-15]等木薯副產物的加工利用，缺乏對木薯塊根青貯后的微生物變化及其對青貯品質的影響和二者間相關性的分析。市場上微生物菌種及酶發酵劑產品豐富多樣，但針對南方地區專用的木薯青貯生物益生菌菌劑種類較少。

因此，本研究以鮮木薯塊根為青貯原料，通過添加不同生物益生菌產品和直接青貯的比較試驗，利用常規營養分析方法和二代測序法，對木薯塊根青貯后的青貯品質和微生物菌群結構及二者間相關性進行分析，篩選適合南方地區鮮木薯塊根青貯的添加菌劑以獲得高品質木薯青貯飼料，為我國南方地區的無抗飼料生產、健康養殖及木薯綜合利用提供實踐應用和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗品種選用華南9 號木薯(SC9)，2019 年3 月20 日在海南省文昌縣田尾基地(110°75′ E，19°61′ N)，將長10 cm 左右的木薯種莖下端呈45°～65°斜插種植于壟中5～7 cm，株行距1.0 m × 1.0 m，采取常規田間管理。于2020 年10 月9 日收獲木薯塊根。將木薯塊根(帶皮)清洗干凈后，用粉碎機(195 汽油機動力)粉碎為1 cm 左右的小塊，供青貯后分析使用。青貯材料干物質(dry matter，DM)含量為31.26%，可溶性糖(water soluble carbohydrates，WSC)含量為25.51%，粗蛋白(crude protein，CP)含量為2.33%，中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)含量為14.73%，酸性洗滌纖維(acid detergent fiber，ADF)含量為5.38%。

添加的生物益生菌分別為微生物發酵菌劑(芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌，濰坊生益生物公司)、高效復合菌酶制劑(芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌、酶，中國熱帶農業科學院生物技術研究所)和生物飼料發酵劑(芽孢桿菌、乳酸桿菌、酵母菌，海南盛旭生物科技有限公司)。

1.2 試驗設計

試驗以新鮮木薯塊根單獨青貯作為對照(CK)，試驗組分別添加微生物發酵菌劑(C1)、高效復合菌酶制劑(C2)和生物飼料發酵劑(C3)共4 個處理，每個處理組3 個重復。嚴格按照各生物益生菌菌劑的使用方法在樣品中加入菌劑，C1在鮮樣中的添加量為5 g·kg?1，C2為 1 g·kg?1，C3為 2 g·kg?1，以10 mL·kg?1蒸餾水溶解，CK 組添加等量的蒸餾水。

1.3 青貯飼料制作

以粉碎后1 cm 左右的木薯塊根為原料，按處理分組添加不同菌劑后充分混勻，裝入30 cm × 20 cm的聚乙烯青貯袋中，每個處理設3 個重復，每袋300 g，用真空打包機抽真空后密封。在室溫 (27 ± 3) ℃條件下遮光貯藏。于青貯第30 天后開封進行營養指標、發酵品質及微生物多樣性的測定。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 青貯飼料營養成分及發酵品質的測定

青貯30 d 后的木薯塊根開袋取樣，65 ℃烘干48 h，粉碎過0.425 mm 篩，然后進行各指標測定。干物質采用烘干法測定[16]；粗蛋白采用凱氏定氮法(海能k1100 全自動凱氏定氮儀)測定[17]；可溶性糖采用蒽酮-硫酸法測定[18]；中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維采用改進后的濾袋分析法用纖維分析儀(SonnenF10 型自動纖維儀)進行測定[19]。

開袋后，將發酵飼料混勻，稱取20 g 樣品放入250 mL 三角瓶中，加入70 mL 蒸餾水攪拌均勻，在4 ℃恒溫冰箱中浸泡 24 h 搖勻后依次用4 層紗布和中速定量濾紙過濾，所得浸提液用pH 計測定發酵飼料的pH[20]；氨態氮(ammonia nitrogen, AN)采用苯酚-次氯酸鈉比色法測定[21]，并計算氨態氮占總氮的比例(ammonia nitrogen/total nitrogen, AN/TN)；有機酸采用液相色譜分析儀測定[22]，浸提液先后抽濾到10 mL 離心管并使用0.22 μm 尼龍有機濾膜過濾，用島津LC-20A 液相色譜儀加載Venusil XBP C18 柱(250 mm × 4.6 mm)進行二元梯度洗脫，在15%甲醇與85% NaH2PO4·H2O (pH 2.65，0.1 mol·L?1)中，總流速1 mL·min?1，單次25 min，柱溫30 ℃，波長210 nm 下測定乳酸(lactic acid, LA)、乙酸(acetic acid, AA)、丙酸(propionic acid, PA)和丁酸(butyric acid, BA)。

1.4.2 微生物多樣性分析

二代測序每組青貯樣本按青貯袋充分混合，取3 個重復樣品，使用 E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit 的試劑盒(OMEGA，美國)提取樣品的總DNA，利用前引物341F (ATGCGTAGCCGACCTGAGA)與后引物805R (CGTCAGACTTTCGTCCATTGC)獲取細菌 Ⅴ3～Ⅴ4 高變異區16S rRNA 基因。PCR 擴增產物回收純化利用Qubit3.0 DNA 檢測試劑盒對基因組DNA 精確定量，采用Illumina 公司的Tru Seq TM DNA Sample PrepKit 制備測序文庫。使用MiSeq測序儀進行2 × 300 bp 的雙端測序并對結果進行分析。Illumina HiSeq 測序和結果分析測序及序列物種信息由生工生物工程(上海)股份有限公司協助完成。

1.5 數據處理

使用Excel 2013 進行數據統計及分析，用SPSS軟件對所有數據進行單因素方差分析及營養成分和發酵品質指標的顯著性檢驗，用Duncan 法對平均值進行多重比較(P< 0.05)。將各處理組干物質、可溶性糖、粗蛋白、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、pH、乳酸、乙酸、氨態氮/全氮共9 個指標采用模糊數學的隸屬函數理論[23]，對其青貯品質進行綜合評價。

式中：xi為當前指標測定值，xmax和xmin為指標最大值和最小值；其中中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、pH 和氨態氮/全氮為反隸屬函數，其他均為正隸屬函數。隸屬函數均值越大，說明其品質越好。

二代測序得到的PE reads 首先根據overlap 關系進行拼接，區分樣本后對序列質量進行質控和過濾，然后進行OTU 聚類(ASV 去噪)分析和物種分類學分析。基于OTU 聚類(ASV 去噪)分析結果，用Usearch、QIIME 以及 Mothur 等軟件進行深入的統計學和可視化生物信息學分析，利用R 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 添加不同生物益生菌對木薯塊根青貯營養成分和發酵品質的影響

與CK 組相比，添加菌劑后3 組的干物質均顯著提高(P< 0.05) (表1)，但3 組間無顯著差異(P>0.05)；添加菌劑后3 組處理可溶性糖含量與CK 組差異均不顯著，但C2和C3組顯著高于C1組；C2組粗蛋白顯著低于CK 組；中性洗滌纖維各組間差異均不顯著；C1和C3組酸性洗滌纖維顯著低于CK組，且兩組間無顯著差異。

表1 添加不同生物益生菌對木薯塊根青貯營養成分和發酵品質的影響Table 1 Effect of adding different biological probiotics on the nutrient composition and fermentation quality of cassava root silage

所有組的pH 均低于4.2，其中C3組顯著低于CK 組(P< 0.05)，C2顯著高于CK 組；添加菌劑的3 組處理乳酸均顯著高于CK 組，其中C1組最高，且C1組乙酸顯著高于CK 組；乳酸/乙酸各組間無顯著差異；所有組均檢測到少量丙酸且組間無顯著差異(P> 0.05)；各組均未檢測到丁酸。所有組氨態氮/總氮均小于10%，其中C2組顯著高于其余各組。

添加不同生物益生菌后，隸屬函數平均值結果(表2)顯示，C3理組的綜合表現最優，平均值為0.79，C1組表現較優，平均值為0.70，C2組隸屬函數值最低，低于CK 組。

表2 添加不同生物益生菌木薯塊根青貯品質的隸屬函數值Table 2 Affiliation function values of cassava tuber silage quality under different bio-probiotic treatments

2.2 添加不同菌劑對木薯塊根青貯微生物多樣性的影響

2.2.1 木薯塊根青貯細菌OTUs 基礎分析

由木薯塊根青貯細菌OTUs 基礎分析(圖1)可知，4 個處理組共獲得174 個OTUs，其中共有的OTUs為146 個，CK 組和C1組獨有的均為2 個，C2和C3組均沒有獨有的，CK、C1、C2和C3組的OTUs 數目分別為165、163、164 和165 個。說明4 組處理間物種分布差異不顯著(P> 0.05)。

圖1 木薯塊根青貯物種分布韋恩圖Figure 1 Venn diagram of cassava root tuber silage species distribution

2.2.2 Alpha 多樣性分析

木薯塊根青貯開封后的微生物Alpha 多樣性指數(表3)表明，測序樣本序列數量較大，且各處理組的覆蓋度均大于0.99，說明基本覆蓋了樣本中所有微生物的核心組成；相較于CK 組，各添加菌劑組的Chao 指數和Ace 指數均有所降低，表明菌群的豐度降低；Shannon 指數的降低和Simpson 指數的增高說明生物菌群多樣性降低，其中C3最低；Shannoneven指數的降低說明菌群分配的均勻程度降低。綜上可知，添加生物益生菌可以影響木薯塊根青貯飼料中微生物群落的多樣性。

表3 不同樣本的Alpha 多樣性指數Table 3 Alpha diversity analysis of different samples

2.2.3 木薯塊根青貯后基于門水平的微生物群落結構

根據物種注釋結果，選取每個樣品在門分類水平上豐度大于1%的菌種，分析各青貯樣品在門分類水平上相對豐度較高的物種及其比例(表4)?；陂T水平的木薯塊根青貯微生物群落結構表明，各處理組的優勢菌門均為厚壁菌門和變形菌門，這兩個在青貯中占主導作用的菌門均占菌群分類的95%以上。除此之外，藍藻細菌門、未分類細菌及其他細菌有少量存在。C1、C2和C3組厚壁菌門的相對豐度相較于CK 組(76.76%)均顯著增加(P< 0.05)，分別達到81.20%、79.59%和82.30%，同時變形菌門的相對豐度相較于CK 組(19.12%)分別降低至17.04%、18.63%和15.58%，其中C3組顯著降低，且藍藻細菌門、未分類細菌和其他細菌豐度均顯著降低。這說明添加菌劑可提高木薯塊根青貯飼料中厚壁菌門所占比例，降低變形菌門所占比例，減少其他細菌產生。

表4 基于門水平的木薯塊根青貯微生物群落結構比例Table 4 Microbial community structure of cassava tuber silage based on phylum level

2.2.4 木薯塊根青貯后基于屬水平的微生物群落結構

根據物種注釋結果，選取每個樣品在屬分類水平上豐度大于1%的菌種，分析各青貯樣品在屬分類水平上相對豐度較高的物種及其比例(表5)。基于門水平的木薯塊根青貯微生物群落結構表明，4 個處理組的優勢菌屬均為乳桿菌屬、乳球菌屬、未分類屬腸桿菌和沙雷菌屬。其中CK 組的4 種菌屬相對豐度分別為56.28%、14.10%、10.85%和6.93%；相較于CK 組，各處理組有益菌屬表現為乳桿菌屬和乳球菌屬有所增高，其中C1、C3組乳桿菌屬相對豐度顯著增高至60.19%、59.33% (P< 0.05)；C2、C3組乳球菌屬的相對豐度顯著增高，分別為16.30%和16.86%；C1組腸球菌屬顯著降低；鏈球菌屬、明串珠菌屬相對豐度各添加菌劑組組均顯著降低；魏斯氏菌屬相對豐度各間均無顯著差異(P> 0.05)。各處理組有害菌屬和雜菌表現為：與CK 相比，C3未分類屬腸桿菌顯著降低，為9.42%；C1、C2和C3組沙雷菌屬相對豐度均顯著降低，分別為5.45%、6.04%和5.09%；未分類細菌相對豐度均顯著降低；不動桿菌屬、未分類乳酸桿菌屬和其他菌屬相對豐度較CK組無顯著差異。

表5 基于屬水平的木薯塊根青貯微生物群落結構比例Table 5 Microbial community structure of cassava tuber silage based on genus level

2.2.5 微生物多樣性與環境相關性

利用Spearman 相關系數研究青貯木薯塊根細菌菌群相對豐度與pH、發酵代謝產物之間的相關性，得到兩兩之間的相關性系數和顯著性。基于門水平青貯品質指標與細菌菌群相關性分析熱圖(圖2)表明，厚壁菌門與LA、AA 顯著正相關(P< 0.05)，與pH、ADF 顯著負相關(P< 0.05)；變形菌門與pH、ADF 顯著正相關(P< 0.05)，與LA 顯著負相關 (P<0.05)；藍藻細菌門與CP 極顯著正相關(P< 0.01)。

圖2 基于門水平青貯品質指標與細菌菌群相關性分析熱圖Figure 2 Heat map of correlation analysis between silage quality indicators and bacterial flora based on phylum level

基于屬水平青貯品質指標與細菌菌群相關性分析熱圖(圖3)表明，乳桿菌屬與ADF 極顯著負相關(P< 0.01)；乳球菌屬與環境因子相關性不顯著(P>0.05)；沙雷菌屬與pH 顯著正相關(P< 0.05)，與ADF極顯著正相關(P< 0.01)，與LA 極顯著負相關(P<0.01)；鏈球菌屬與CP 極顯著正相關(P< 0.01)，與DM 顯著負相關(P< 0.05)，明串珠菌屬與CP 顯著正相關(P< 0.05)，與DM 顯著負相關(P< 0.05)；魏斯氏菌屬與LA 極顯著正相關(P< 0.01)，與AA 顯著正相關(P< 0.05)；腸球菌屬與DM 顯著負相關(P< 0.05)；不動桿菌屬與ADF 顯著正相關(P< 0.05)，與DM 顯著負相關(P< 0.05)。

圖3 基于屬水平青貯品質指標與細菌菌群相關性分析熱圖Figure 3 Heat map of correlation analysis between silage quality indicators and bacterial flora based on genus level

3 討論與結論

3.1 添加不同菌劑對木薯塊根青貯營養成分和發酵品質的影響

本研究結果顯示，添加菌劑對木薯塊根的營養品質和發酵效果有著不同程度的影響。與CK 組相比，添加菌劑后3 個處理組的干物質均顯著提高(P<0.05)，可能是可溶性糖含量較高情況下，添加菌劑加速乳酸產生，減少了有害微生物的含量，從而減少了干物質的損失[24]；中性洗滌纖維和可溶性糖含量差異均不顯著(P> 0.05)，與陸永祥等結果相似[25]；C1和C3組酸性洗滌纖維顯著低于CK 組(P< 0.05)，可能是由于較低pH 構成的酸性環境促進了細胞壁成分的酸解作用[26]；粗蛋白的降解會影響飼料的營養價值，C2組粗蛋白含量顯著低于CK 組(P< 0.05)，可能存在某些降解蛋白的菌促進蛋白的分解[27]。

pH、有機酸是衡量青貯飼料發酵品質的重要指標，品質優良的青貯飼料的pH 在4.2 以下[28]。本研究4 個處理組的pH 均在3.6 左右，發酵效果極好，主要是由于木薯本身干物質、可溶性糖含量較高，添加菌劑后為發酵提供了更多底物，使其迅速發酵產生乳酸降低pH，這與Zhang 等[29]在濕玉米麩皮和玉米秸稈混合飼料中加入乳酸菌菌劑后pH 比不添加任何菌劑的對照組更低的研究結果一致。添加生物益生菌處理組的乳酸相較于CK 組均顯著提高(P< 0.05)，其中C1組乙酸的含量顯著高與CK 組(P<0.05)，可能是添加的菌劑主成分均為乳酸菌菌種，提高了產乳酸能力，與王丹丹[30]在玉米(Zea mays)中加入微生物添加劑后乳酸和乙酸有顯著增高的研究一致。丁酸是蛋白質和乳酸被腐敗菌分解所產生，本研究中各組均未檢測出丁酸，只檢測到少量丙酸，說明飼料發酵品質較高[31]。乳酸/乙酸始終高于3，說明木薯塊根青貯發酵過程主要以同型乳酸發酵為主。本研究中各組氨態氮/總氮均小于10%，達到優質青貯飼料標準，說明氨基酸和蛋白質分解較少[32]，而C2組的氨態氮/總氮顯著高于CK 組(P<0.05)，這主要是由于C2組pH 較CK 組高，導致一些以蛋白質為營養的有害微生物增殖，產生相對較多的氨態氮。

本研究中的4 個處理組青貯品質均達到優質青貯飼料標準，但添加菌劑增加干物質和可溶性糖等發酵底物含量和產酸能力，并降低酸性洗滌纖維等不易被動物吸收的物質含量。將各項營養和發酵指標通過模糊數學隸屬函數法進行綜合分析，各指標平均隸屬函數值越高則代表青貯品質越好，對比可以看出C3組的綜合表現最優，其次為C1組，C2組則排在最后，所以在不同生物益生菌處理中的木薯塊根青貯品質為C3> C1> C2。

3.2 添加不同菌劑對木薯塊根青貯微生物多樣性的影響

復雜的微生物在青貯過程中存在共生且有著相互作用的關系，微生物多樣性也與青貯品質有著一定的相關性[8]。本研究采用高通量測序技術對添加不同生物益生菌菌劑的木薯塊根青貯后微生物菌群群落結構進行分析，從豐度、結構等定義微生物的多樣性。從木薯塊根青貯細菌OTUs 基礎分析結果來看，添加生物益生菌菌劑對物種分布差異影響不大；但由Alpha 多樣性分析結果顯示，木薯塊根青貯后微生物的多樣性有一定的影響，相較于CK 組，菌群的豐度、多樣性和分配的均勻程度均降低，這種變化可能是受群落里優勢菌屬的影響，有研究表明優勢菌屬越豐富，細菌群落的多樣性越少[33]，Wang 等[34]在辣木(Moringa oleifera)乳酸菌接種青貯飼料中發現乳酸桿菌的高豐度導致細菌多樣性低與本研究結果相似。上述結果說明添加生物益生菌菌劑會影響木薯塊根青貯飼料微生物群落結構的多樣性。

根據高通量測序結果在門水平上分析核心菌群，4 個木薯塊根青貯處理組在菌群組成上并無明顯差異，各組的優勢菌門均為厚壁菌門和變形菌門。其中厚壁菌門與LA、AA 含量顯著正相關(P<0.05)，與pH、ADF 顯著負相關(P< 0.05)，是因為厚壁菌門中多是參與乳酸發酵的菌群，其豐度增加提高了產酸能力導致pH 降低，并對酸性洗滌纖維進行進一步分解，從而提高發酵品質[35]；本研究中各添加菌劑組的厚壁菌門相對豐度相較于CK 組均顯著提高(P< 0.05)，其中C3組的相對豐度最高，其次是C1、C2組。變形菌門與pH、ADF 顯著正相關(P<0.05)，與LA 顯著負相關(P< 0.05)，是由于變形菌門部分菌屬能進行脫氨反應生成氨，使pH 的降低減緩的同時可與乳酸菌競爭可溶性糖的利用，對酸性洗滌纖維的分解和乳酸的產生起到不利的影響，這與閆晶等[36]發現變形菌門與pH 呈正相關關系的研究結果相同；本研究中添加菌劑后變形菌門相對豐度均降低，其中C3相對豐度顯著降低，其次是C1、C2組。添加益生菌后藍藻細菌門和其他菌均顯著降低，且藍藻細菌門與CP 極顯著正相關(P< 0.05)，說明處理組CP 含量降低可能與此菌門豐度降低有一定關聯。綜上，添加生物益生菌能增加厚壁菌門所占比例，減少變形菌門和其他菌類占比，與王麗學等[37]在苜蓿(Medicago sativa)中添加乳酸菌改善細菌菌群結構的研究結果基本一致。

在屬水平上分析核心菌群，各處理組的優勢菌屬均為乳桿菌屬、乳球菌屬，其次為未分類腸桿菌屬和沙雷菌屬。乳桿菌屬是青貯發酵的主要菌屬，在pH 較低環境下可以正常生長，是導致本研究中厚壁菌門微生物含量多的直接原因[38]，乳球菌屬占比相對較少則是因為不如乳桿菌屬耐酸[39]；魏斯氏菌屬為異型發酵乳酸菌，有較強耐酸堿性，與LA、AA 有正相關關系[40]；鏈球菌屬和明串珠菌相對豐度在接種生物益生菌后顯著減少(P< 0.05)，可能是因為生物益生菌的添加導致發酵環境中的酸堿度快速下降，從而降低了這類不耐酸菌屬的豐度，這與Yang 等[41]發現低pH 是酸性環境中微生物多樣性有限的主要因素和Wang 等[42]在辣木中接種乳酸菌后乳酸桿菌增強，腸桿菌、腸球菌和豌豆球菌的相對豐度則降低等研究結果相似。且CP 含量與其存在正相關關系，DM 與其存在負相關關系，所以C2組的CP 含量降低和3 個處理組的DM 含量增高可能與其豐度降低有關；沙雷菌屬及其主要發酵產物與酸化環境有關，或至少在這種條件下維持[43]，其與pH 和ADF 正相關，與LA 負相關，是因為沙雷菌屬、未分類腸桿菌屬和不動桿等菌屬等為變形菌門下菌屬。正是由于發酵過程中乳桿菌屬、乳球菌屬、魏斯氏菌屬、明串珠菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬等有益乳酸菌群占據優勢主導地位，生成一定量的乳酸使pH 快速下降，才使得上述腐敗菌被有效抑制，從而更好地保證飼料的發酵品質。綜上，添加生物益生菌菌劑后乳桿菌屬、乳球菌屬豐度增高，未分類腸桿菌、沙雷菌屬豐度的降低，可以說明木薯塊根青貯中添加生物益生菌菌劑可以增強產酸能力強的乳酸菌菌種的豐度，且抑制有害菌群的繁殖，從而提高發酵飼料品質。

綜上，添加生物益生菌菌劑對木薯塊根青貯的營養品質和發酵品質有不同程度的改善，從菌群結構看，添加菌劑能提高木薯塊根青貯飼料中厚壁菌門下乳酸菌菌種的豐度，降低變形菌門下沙雷菌屬和不動桿菌屬等菌屬的豐度，減少雜菌產生，且菌群結構的改變與青貯品質指標有一定相關性。其中，厚壁菌門菌群豐度為C3> C1> C2，變形菌門菌群豐度為C3< C1< C2，其各菌門下各菌屬菌群豐度與此趨勢相同。所以綜合各項指標及微生物群落結構的分析判斷，木薯塊根 青貯效果表現為C3> C1> C2。