細胞培養用“胰蛋白酶”還是“膠原蛋白酶”

謝宏妮 李雪峰

摘要 主要從胰蛋白酶和膠原蛋白酶的作用特點、使用方法等方面考慮，闡明細胞的傳代培養一般只選用胰蛋白酶的原因，為一線教師教學提供參考。

關鍵詞 胰蛋白酶 膠原蛋白酶 原代培養 傳代培養

中圖分類號 Q-49

文獻標志碼 E

2021年廣東省普通高中學業水平選擇考適應性測試（生物學）中第22題（選修3：現代生物科技專題）的第4小題的第二個填空，有關貼壁細胞的傳代培養常用什么酶進行消化處理一問，超過30%的學生填寫了“膠原蛋白酶”，與答案不符。

事實上，在人教版高中生物學新舊兩版教材《選擇性必修3·生物技術與工程》《選修3·現代生物科技專題》中，對于細胞培養用“胰蛋白酶”還是“膠原蛋白酶”這一問題均有直接闡述，但沒有說明二者區別并辨析相關原因。例如，在《選擇性必修3·生物技術與工程》中，表述為“在進行細胞培養時，首先要對新鮮取材的動物組織等進行處理，或用機械的方法，或用胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理一段時間，將組織分散成單個細胞”“在進行傳代培養時，貼壁細胞需要重新用胰蛋白酶等處理，使之分散成單個的細胞”。從學生對相關問題的作答情況來看，他們明顯混淆了“胰蛋白酶”和“膠原蛋白酶”的作用特點及情況。這可能是教師與學生對教材相關描述的誤解所導致。

盡管胰蛋白酶和膠原蛋白酶都是細胞培養中常用于將體積較小的組織塊分散成細胞團或單細胞的消化液，但它們的作用機制及適用情況并不相同。下面旨在通過胰蛋白酶和膠原蛋白酶的作用特點、使用方法等，闡明兩種酶的區別與細胞培養中的使用情況。

1胰蛋白酶和膠原蛋白酶的作用特點

1.1胰蛋白酶的作用特點

胰蛋白酶分離自牛、豬等動物的胰，作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽鏈，除去細胞間黏蛋白及糖蛋白，從而使細胞分離，是應用廣泛的消化物，適于消化細胞間質較少的軟組織，如胚胎組織、羊膜、上皮組織、肝、腎等軟組織以及傳代細胞等。胰蛋白酶的消化作用與酶的濃度、pH、溫度、組織塊的大小以及組織的硬度都有關系。胰蛋白酶濃度過大或消化時間太長，會導致細胞被消化;但反之消化不充分也達不到分散細胞的目的。此外，血清明顯抑制胰蛋白酶的活性，Ca2+和Mg2+對胰蛋白酶的活性有一定抑制作用。

1.2膠原蛋白酶的作用特點

膠原蛋白酶是能在一定的pH和溫度下切割膠原蛋白主體螺旋多肽鏈的酶類，主要用于水解結締組織中的膠原蛋白，適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織等。當擬消化的組織較硬，內含較多的結締組織或膠原成分時，用胰蛋白酶解離細胞效果較差，可采用膠原酶解離細胞法。鈣、鎂離子以及血清不會影響膠原酶的消化作用，其消化作用緩和，且無需機械振蕩（表1）。

與胰蛋白酶不同的是許多動物的組織細胞和微生物都是它的來源，其中細菌是微生物膠原蛋白的主要來源，已發現40多種。目前商業化提供的細菌膠原酶主要根據膠原酶活性的差異，分為4種類型：

（1）膠原酶I型：含有比較均勻的各種酶活力（包括膠原酶、酪蛋白酶、梭菌蛋白酶、胰蛋白酶活性），通常用作上皮細胞、肝、肺、脂肪和腎上腺組織細胞的制備。

（2）膠原酶II型：含有更高的梭菌蛋白酶活性，通常用于心臟、骨、肌肉、胸腺和軟骨等組織來源細胞的制備。

（3）膠原酶III型：含有較低的蛋白酶活性，常用于乳腺細胞的制備。

（4）膠原酶IV型：含有低胰酶活性，通常用于胰島細胞的制備，或者需要維持受體完整性的細胞制備實驗。

2兩種蛋白酶在細胞培養中的應用

2.1原代培養原代培養是從供體獲取組織或細胞進行的首次

培養，也叫初代培養。由于取得的組織和細胞剛剛離體，生物性狀尚未發生較大變化，具有二倍體遺傳性狀，在供體來源充分、條件穩定的情況下（年齡、性別），能在一定程度上反映體內狀態。原代培養的組織通常由多種細胞成分組成，較為復雜，即使培養較純的單一類型的細胞，如上皮或成纖維細胞，也仍然存在著異質性。正因如此，胰蛋白酶和膠原酶均可在原代細胞培養中的酶消化培養法中使用，以便將組織塊分散成細胞團或單個細胞，使細胞從培養液中攝取營養和排出代謝產物，從而達到細胞快速長成單層的目的。本法尤適用于培養大量組織，細胞產量高。

2.2傳代培養

當原代培養成功，細胞生長增殖形成單層細胞后，會進一步擴展匯合，占滿一切空間。此時，就需要進行分離培養，這一操作即稱為傳代或再培養。傳代培養一般選擇細胞生長的對數期進行。對于貼壁生長細胞的傳代培養而言，通常采用酶消化法，且一般選用胰蛋白酶。這是因為傳代培養的過程其實就是細胞的分離稀釋，此時細胞間質較少，且不含較多的結締組織或膠原成分。