Kex2 蛋白酶K291 突變體性質(zhì)和動(dòng)力學(xué)研究

楊 帆， 劉 曉， 王之可， 李素霞

（1. 華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237；2. 上海雅心生物技術(shù)有限公司，上海 200231）

Kex2 蛋白酶是一種鈣離子依賴(lài)型的絲氨酸蛋白酶，可以特異性識(shí)別兩個(gè)連續(xù)的堿性氨基酸并在第二個(gè)堿性氨基酸的羧基端肽鍵進(jìn)行切割[1-3]。Kex2 蛋白酶包含814 個(gè)氨基酸殘基，分為7 個(gè)結(jié)構(gòu)域：信號(hào)肽（1～19 氨基酸殘基）、前肽（20～113 氨基酸殘基）、催化結(jié)構(gòu)域（114～410 氨基酸殘基）、P 結(jié)構(gòu)域（411～624 氨基酸殘基）、絲氨酸/蘇氨酸富集區(qū)（625～679 氨基酸殘基）、跨膜區(qū)（680～699 氨基酸殘基）以及胞漿區(qū)（700～814氨基酸殘基）[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽、跨膜區(qū)和胞漿區(qū)這3 個(gè)結(jié)構(gòu)域與Kex2 蛋白酶的活性無(wú)關(guān)，去除這些結(jié)構(gòu)域不會(huì)影響蛋白酶的活性，因此在表達(dá)時(shí)通常只表達(dá)前肽至絲氨酸/蘇氨酸富集區(qū)這4 個(gè)結(jié)構(gòu)域的氨基酸片段[6-9]。

Kex2 蛋白酶在生物醫(yī)藥行業(yè)有廣泛應(yīng)用前景，相比胰蛋白酶，Kex2 酶切位點(diǎn)更特異。為了能夠得到高產(chǎn)量的Kex2 蛋白酶，研究人員嘗試了多種不同類(lèi)型的表達(dá)系統(tǒng)，結(jié)果表明畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)Kex2 蛋白酶效率最高[10-13]。本實(shí)驗(yàn)室成功利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了含有Kex2 前肽、催化結(jié)構(gòu)域、P 結(jié)構(gòu)域和絲氨酸/蘇氨酸富集區(qū)結(jié)構(gòu)域的20～667 位氨基酸殘基序列，利用畢赤酵母α-信號(hào)肽取代原Kex2 信號(hào)肽（1～19 氨基酸殘基），可以得到直接分泌到胞外的目的蛋白[14]。然而在純化過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，Kex2 蛋白酶會(huì)出現(xiàn)自降解的現(xiàn)象，產(chǎn)生多條雜條帶，酶活性降低。在分析其氨基酸序列后發(fā)現(xiàn)，Kex2 蛋白酶自身結(jié)構(gòu)中含有多對(duì)連續(xù)堿性氨基酸殘基位點(diǎn)，這可能是導(dǎo)致其自降解的原因。

結(jié)合降解條帶的分子量和蛋白結(jié)構(gòu)分析[15]，篩選到了一個(gè)最有可能的潛在降解位點(diǎn)K290-K291。該位點(diǎn)位于α-螺旋處，且暴露于整個(gè)蛋白分子的表面，非常容易被識(shí)別并被切割。此外，該位點(diǎn)在空間結(jié)構(gòu)上距離催化三聯(lián)體Ser385-His213-Asp175 較遠(yuǎn)，突變后不會(huì)影響蛋白酶催化活性。根據(jù)氨基酸的帶電荷情況和側(cè)鏈R 基團(tuán)，選擇組氨酸（His）和亮氨酸（Leu）作為突變后氨基酸。經(jīng)過(guò)分析后發(fā)現(xiàn)，His 與原位點(diǎn)賴(lài)氨酸（Lys）均帶正電荷，Leu 的側(cè)鏈R 基團(tuán)與Lys 的側(cè)鏈R 基團(tuán)相比，除了減少一個(gè)氨基外，碳原子個(gè)數(shù)相同，因此決定選擇這兩種氨基酸。

本文將K291 位點(diǎn)的Lys 突變?yōu)镠is 和Leu，對(duì)突變體的降解情況和穩(wěn)定性、動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究，并將天然Kex2 與突變體進(jìn)行了比較。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與菌株

含Kex2基因序列的質(zhì)粒pPIC9K 和宿主細(xì)胞畢赤酵母菌株GS115 均由本實(shí)驗(yàn)室保存，

1.2 主要試劑和培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)所用內(nèi)切酶、連接酶和蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自Takara 生物有限公司，測(cè)活底物叔丁氧羰-谷氨酰胺-精氨酸-精氨酸-對(duì)硝基苯胺（Boc-Gln-Arg-ArgpNA）購(gòu)自Sigma 公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。MD（Minimal Dextrose）培養(yǎng)基（1.34 g/mL YNB (Yeast Nitrogen Base without Amino Acids)，2 g/mL 葡萄糖，4×10?5g/mL 生物素），YPD（Yeast Extract Peptone Dextrose）培養(yǎng)基（1 g/mL 酵母提取物，2 g/mL 蛋白胨， 2 g/mL 葡萄糖） ， BMGY（ Buffered Glycerol-Complex）培養(yǎng)基（1 g/mL 酵母提取物，2 g/mL 蛋白胨，1.34 g/mL YNB，100 mmol/L 磷酸鉀緩沖液，4×10?5g/mL 生物素，體積分?jǐn)?shù)為1%甘油，pH 5.0），BMMY（Buffered Methanol-Complex）培養(yǎng)基（1 g/mL酵母提取物，2 g/mL 蛋白胨，1.34 g/mL YNB，100 mmol/L磷酸鉀緩沖液，4×10?5g/mL 生物素，體積分?jǐn)?shù)為1%甲醇，pH 5.0）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 點(diǎn)突變構(gòu)建 使用重疊延伸生物學(xué)的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法構(gòu)建點(diǎn)突變。突變位點(diǎn)K291 在蛋白空間結(jié)構(gòu)中的位置如圖1所示。在Kex2 蛋白酶原始序列中找到對(duì)應(yīng)的核酸序列，根據(jù)畢赤酵母的偏好性設(shè)計(jì)突變引物，引物序列如表1 所示。進(jìn)行兩次PCR 反應(yīng)得到突變后的核酸序列，經(jīng)過(guò)連接、轉(zhuǎn)化和篩選后，挑選陽(yáng)性重組子送至生工生物(Sangon Biotech)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

圖1 Kex2 蛋白酶的三維結(jié)構(gòu)Fig. 1 Three-dimensional structure of Kex2 protease

表1 突變引物Table 1 Primers of mutants

1.3.2 重組畢赤酵母菌株的篩選 重組子測(cè)序確認(rèn)正確后進(jìn)行質(zhì)粒少量抽提。選取SalⅠ限制性內(nèi)切酶將質(zhì)粒線性化，然后使用電擊轉(zhuǎn)化法將線性化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115 中，菌液先涂布于MD 平板進(jìn)行第一次篩選，然后收集菌落，重新涂布于含有質(zhì)量濃度分別為1、2、3 mg/mL 的遺傳霉素G418 的YPD 平板進(jìn)行第二次篩選。

1.3.3 誘導(dǎo)表達(dá)和純化 挑取含高濃度G418 的YPD 平板上的單菌落至YPD 液體培養(yǎng)基中，待菌液濃度OD600達(dá)到2.0 時(shí)，再接種至BMGY 培養(yǎng)基中，待菌液濃度OD600為20.0 時(shí)，菌液離心，將菌體重懸于BMMY 培養(yǎng)基中，每24 h 添加終濃度為1%（體積分?jǐn)?shù)）的甲醇，誘導(dǎo)72 h。

誘導(dǎo)結(jié)束后離心菌液，將上清液進(jìn)行透析（透析液為20 mmol/L 乙酸鈉-乙酸緩沖液，pH 5.2），去除上清液中高濃度的磷酸鹽和色素小分子。使用Q-FF陰離子交換柱進(jìn)行純化，并用pH5.2、20 mmol/L NaCl、20 mmol/L 乙酸鈉-乙酸緩沖液和pH5.2、200 mmol/L NaCl、20 mmol/L 乙酸鈉-乙酸緩沖液等體積線性洗脫，分步收集洗脫液，用SDS-PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis)鑒定蛋白純度，超濾除鹽后測(cè)定蛋白酶活性。

1.3.4 活性測(cè)定方法 底物為叔丁氧羰-谷氨酰胺-精氨酸-精氨酸-對(duì)硝基苯胺（Boc-Gln-Arg-Arg-pNA）。該底物在405 nm 處無(wú)吸光值，當(dāng)Kex2 蛋白酶在RR 位點(diǎn)切割后，產(chǎn)生了兩個(gè)片段Boc-Gln-Arg-Arg 和pNA，pNA 在405 nm 處有吸光值，且吸光值大小與濃度成正比。

酶活力定義為：在25 ℃、pH8.0 的條件下，每分鐘催化1 μmol 的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需要的酶量。將底物溶于50 mmol/L Tris-HCl、 pH8.0、 2 mmol/L CaCl2的測(cè)活緩沖液中，置于25 ℃水浴中孵育30 min以上，取3 mL 底物于玻璃比色皿中，加入適量酶，在波長(zhǎng)405 nm 下，每間隔30 s 記錄吸光值A(chǔ)405，連續(xù)記錄5 min，然后根據(jù)式(1)計(jì)算酶活：

其中，ΔA為測(cè)量時(shí)間段內(nèi)吸光值A(chǔ)405的差值；VT為測(cè)活體系總體積；ΔT為測(cè)量時(shí)長(zhǎng)；VS為測(cè)活體系中加入酶的體積；L為比色皿光程（L=1cm）；ε 為反應(yīng)體系中pNA 的摩爾消光系數(shù)，ε=1.02 ×104L/(mol·cm)。

1.3.5 最適溫度與溫度穩(wěn)定性 按照標(biāo)準(zhǔn)配制底物，將底物溶解于50 mmol/L Tris-HCl、pH8.0, 2 mmol/L CaCl2的緩沖液中，置于不同溫度（4、25、37、60 ℃）水浴中孵育2 h 后加入適量蛋白酶測(cè)定活性。將測(cè)得的活性最高的一組作為100%，計(jì)算其他溫度下蛋白酶的相對(duì)活性，以溫度為橫坐標(biāo)，蛋白酶的相對(duì)活性為縱坐標(biāo)作圖。

將純化后的Kex2 蛋白酶在不同溫度（4、25、37 ℃）水浴下孵育，每2 h 測(cè)定不同溫度處理后的蛋白酶的活性，結(jié)果為3 組平行實(shí)驗(yàn)的平均值。以未經(jīng)處理蛋白酶的活性為100%，以溫度為橫坐標(biāo)，不同溫度和時(shí)間處理后的蛋白酶的殘留活性為縱坐標(biāo)作圖。

1.3.6 最適pH 與pH 穩(wěn)定性 將測(cè)活底物分別溶解在不同pH 值的緩沖液中，在25 ℃水浴中放置2 h后，加入適量蛋白酶測(cè)定活性。將測(cè)得的活性最高的一組作為100%，計(jì)算其他pH 值下蛋白酶的相對(duì)活性。以pH 值為橫坐標(biāo)，相對(duì)活性為縱坐標(biāo)作圖。不同pH 值的緩沖溶液包括50 mmol/L NaAc-HAc(pH 3.0 ～ 6.0)，50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.0 ～ 8.0)和50 mmol/L Gly-NaOH (pH 9.0 ～ 10.0)。

將純化后的蛋白樣品進(jìn)行超濾濃縮，然后稀釋至不同pH 值的緩沖液中，在4 ℃水浴中處理12 h后測(cè)定蛋白酶活性，結(jié)果為3 組平行實(shí)驗(yàn)的平均值。以測(cè)得的活性最高的一組作為100%，計(jì)算經(jīng)不同pH 緩沖液處理后的蛋白酶的相對(duì)活性。以pH 值為橫坐標(biāo)，蛋白酶的相對(duì)活性為縱坐標(biāo)作圖。

1.3.7 動(dòng)力學(xué)參數(shù) 利用Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)作圖法得到各蛋白酶的米氏常數(shù)（Km）和最大反應(yīng)速率（Vmax）：配制濃度(c)分別為10、20、30、50、100、200、300 μmol/L 的底物，在不同底物濃度下測(cè)定蛋白酶的反應(yīng)速率v（μmol/min），然后以1/v?1/c作圖，擬合出一條直線，其橫軸截距為?1/Km，縱軸截距為1/vmax。

2 結(jié)果與討論

2.1 Kex2 蛋白酶突變體表達(dá)與純化

在培養(yǎng)基中每24 h 添加體積分?jǐn)?shù)為1%甲醇溶液進(jìn)行誘導(dǎo)，取樣離心后取上清液進(jìn)行電泳鑒定，結(jié)果如圖2（a）所示，Kex2 蛋白酶的天然形式和突變體均成功表達(dá)，在甲醇的誘導(dǎo)下分泌到培養(yǎng)液中，表觀分子量為75 kDa。經(jīng)過(guò)Q-FF 純化后，SDS-PAGE 電泳檢測(cè)如圖2（b）所示，天然Kex2 蛋白酶在純化過(guò)程中發(fā)生了降解，出現(xiàn)了非單一條帶，在66 kDa 處出現(xiàn)了一條雜條帶，而突變體在純化過(guò)程中未發(fā)現(xiàn)明顯的降解，仍為單一條帶。測(cè)定蛋白濃度和活性后計(jì)算得到蛋白酶比活分別為：天然Kex2 蛋白酶 55.6 U/g，突變體Kex2-K291H 107.7 U/g，突變體Kex2-K291L 143.8 U/g。

圖2 天然Kex2 蛋白酶和突變體的誘導(dǎo)表達(dá)（a）和Q-FF 純化結(jié)果（b）Fig. 2 Expression (a) and purification by Q-FF (b) of the wild Kex2 protease and mutants

2.2 蛋白酶的最適溫度和溫度穩(wěn)定性

本文在不同溫度下測(cè)定蛋白酶的活性，結(jié)果如圖3（a）所示。隨著反應(yīng)體系的溫度升高，蛋白酶的反應(yīng)速率也逐漸升高。但是考慮到該測(cè)活過(guò)程中反應(yīng)時(shí)間僅為5 min，反應(yīng)時(shí)間較短，而在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中蛋白酶的加工時(shí)間要長(zhǎng)于5 min，通常為1 h 甚至更長(zhǎng)，因此本文又將蛋白酶與底物在相同的溫度下分別放置30 min 后，再將蛋白酶與底物混合進(jìn)行活性測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3（b）所示。兩種突變體Kex2-K291H 和Kex2-K291L 分別與天然Kex2 蛋白酶進(jìn)行顯著性差異分析，兩次計(jì)算得到的P值均大于0.05，即突變體Kex2-K291H 和Kex2-K291L 與天然Kex2 蛋白酶的最適溫度差異不顯著。天然Kex2 蛋白酶和兩種Kex2 突變體的最適溫度保持一致，都能在37 ℃條件下于一段時(shí)間內(nèi)保持較高的活性。當(dāng)反應(yīng)體系溫度超過(guò)40 ℃后，蛋白酶無(wú)法長(zhǎng)久保持穩(wěn)定，雖然在較短時(shí)間內(nèi)呈現(xiàn)較高活性，但隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，蛋白酶活性呈下降趨勢(shì)。根據(jù)這兩種測(cè)定方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，若在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行測(cè)活，可以使用溫度較高的反應(yīng)體系；若要進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間反應(yīng)，最好在低于37 ℃條件下進(jìn)行反應(yīng)。

圖3 天然Kex2 蛋白酶和突變體的最適溫度Fig. 3 Optimal temperature of wild Kex2 protease and mutants

蛋白酶測(cè)活均在25 ℃反應(yīng)體系中進(jìn)行，蛋白酶的溫度穩(wěn)定性比較結(jié)果如圖4 所示。兩種突變體Kex2-K291H 和Kex2-K291L 分別與天然Kex2 蛋白酶溫度穩(wěn)定性結(jié)果進(jìn)行顯著性差異分析，兩次計(jì)算得到的P值均大于0.05，即突變體Kex2-K291H 和Kex2-K291L 與天然Kex2 蛋白酶的溫度穩(wěn)定性差異不顯著。在4 ℃和25 ℃條件下，兩種突變體的穩(wěn)定性與天然Kex2蛋白酶的穩(wěn)定性都較好，24 h 后仍能保留90%以上的活性。在37 ℃條件下，兩種突變體和天然Kex2 蛋白酶的穩(wěn)定性趨勢(shì)基本相同，在12 h內(nèi)均能保留90%以上的活性，但當(dāng)時(shí)間延長(zhǎng)至24 h后，蛋白酶穩(wěn)定性呈下降趨勢(shì)。

圖4 天然Kex2 蛋白酶與突變體的溫度穩(wěn)定性比較Fig. 4 Comparison of temperature stability between wild Kex2 protease and mutants

2.3 最適pH 值和pH 穩(wěn)定性

將測(cè)活底物分別溶解在不同pH 值的測(cè)活緩沖液中，在25 ℃下加入蛋白酶進(jìn)行測(cè)活，最適pH 值實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5 所示，天然Kex2 蛋白酶與Kex2 蛋白酶突變體的最適pH 值相同，均為9.0。當(dāng)反應(yīng)體系的pH 值低于5.0 時(shí)，蛋白酶的活性完全喪失；當(dāng)反應(yīng)體系的pH 值在5.0～8.0 范圍內(nèi)，蛋白酶的活性逐漸升高，在pH 值為9.0 時(shí)達(dá)到最高；當(dāng)反應(yīng)體系的pH 值高于10.0 時(shí)，蛋白酶活性又開(kāi)始迅速降低。兩種突變體Kex2-K291H 和Kex2-K291L 分別與天然Kex2 蛋白酶的最適合pH值進(jìn)行顯著性差異分析，兩次計(jì)算得到的P值均大于0.05，即突變體Kex2-K291H 和Kex2-K291L 與天然Kex2 蛋白酶的最適pH 差異不顯著。

圖5 天然Kex2 蛋白酶與突變體的最適pH 值Fig. 5 Optimal pH value of wild-type Kex2 protease and mutants

天然Kex2 蛋白酶和Kex2 蛋白酶突變體在不同pH 條件下放置12 h 后，殘留的活性如圖6 所示。由圖可知，三者的活性變化趨勢(shì)是一致的，在pH5.0～6.0 范圍內(nèi)，蛋白酶的活性相對(duì)穩(wěn)定，但Kex2-K291H 和Kex2-K291L 穩(wěn)定的pH 范圍要明顯大于天然Kex2。當(dāng)pH>7.0 時(shí)，天然Kex2 蛋白酶的活性開(kāi)始逐漸下降，而當(dāng)pH>8.0 時(shí)，Kex2-K291H 和Kex2-K291L 的活性才開(kāi)始下降。

圖6 天然Kex2 蛋白酶與突變體pH 穩(wěn)定性Fig. 6 pH stability of wild-type Kex2 protease and mutants

對(duì)兩種突變體Kex2-K291H 和Kex2-K291L 與天然Kex2 蛋白酶的pH 穩(wěn)定性進(jìn)行顯著性差異分析，結(jié)果表明，突變體Kex2-K291L 與天然Kex2 蛋白酶顯著性差異P>0.05，即兩者的pH 穩(wěn)定性差異不顯著；但突變體Kex2-K291H 與天然Kex2 蛋白酶顯著性差異P=0.0379<0.05，即兩者的pH 穩(wěn)定性差異顯著。

2.4 動(dòng)力學(xué)參數(shù)

天然Kex2 蛋白酶和Kex2 蛋白酶突變體的Lineweaver-Burk 曲線如圖7 所示，根據(jù)擬合后的直線計(jì)算得到各蛋白酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)（表2）。天然Kex2 蛋白酶的Km值為0.037 mmol/L，突變體Kex2-K291H 的Km值為0.018 mmol/L，突變體Kex2-K291L的Km值為0.019 mmol/L，與天然Kex2 蛋白酶相比，兩種突變體的Km值均減小。突變體Kex2-K291H的催化效率指數(shù)（Kcat/Km）為天然Kex2 的1.85 倍，突變體Kex2-K291L 的Kcat/Km值為天然Kex2 的2.05 倍。

圖7 Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)圖分析動(dòng)力學(xué)參數(shù)Fig. 7 Lineweaver-Burk plots analysis of the kinetic parameters

表2 Kex2 蛋白酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 2 Kinetic parameters of Kex2 proteases

3 結(jié) 論

（1）利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了Kex2 蛋白酶K291 位點(diǎn)的兩種突變體Kex2-K291H 和Kex2-K291L。

（2）對(duì)比天然Kex2 蛋白酶和Kex2 突變體的降解情況，Kex2-K291H 和Kex2-K291L 的降解條帶基本消失，為單一條帶。

（3）與天然Kex2 蛋白酶相比，突變體Kex2-K291H 的穩(wěn)定pH 范圍擴(kuò)大，在pH5.0～7.0 范圍內(nèi)均能保持較高的穩(wěn)定性。而兩種突變體的最適溫度、溫度穩(wěn)定性、最適pH 值仍與天然Kex2 蛋白酶保持一致。

（4）突變體Kex2-K291H 和Kex2-K291L 的催化效率提高，兩者的Kcat/Km值分別為天然Kex2 蛋白酶的1.85 倍和2.05 倍。