煙草根際促生菌的分離鑒定及抗菌、促生特性

鐘 釧，高 峻，凌愛芬*，陳 強，趙 珂，孟 霖

(1.四川省煙草公司涼山州公司會東分公司；四川 西昌 615200；2.四川省煙草公司涼山州公司，四川 西昌 615200；3.四川農業大學，成都 溫江 611130；4.中國農業科學院煙草研究所，山東 青島 266101)

煙草是我國重要的經濟作物，四川省是全國的產煙大省，全省煙草種植主要分布在涼山、攀枝花、瀘州、宜賓和廣元五大煙區。其中，涼山州煙區地處川西南橫斷山系東北緣，具備得天獨厚的自然條件，生產的煙葉氣味清香獨特，屬于西南高原生態區-清甜香型，是優質煙葉發展最適宜區之一[1-2]。然而隨著植煙年限的增加，已出現煙葉植煙土壤環境變差、土壤養分供給失衡、煙葉質量下降以及烤煙生產效益下降等問題[3]。植物根際促生菌(Plant Growth Promoting Rhizomicrobe，PGPR)是一類定植于植物根部并對植物生長產生積極影響的微生物群，可提高營養物質在根際的積累、促進植物生長、抑制病原微生物的危害及提高植物抗逆能力等一類有益微生物[4]。因此，因地制宜地篩選與當地植煙品種相匹配的PGPR菌，為進一步研發煙草專用全元微生物肥料提供優良菌種，是確保植煙土壤的“提質增效”的一個有效途徑。

放線菌是土壤微生物的重要組成部分，大量的研究表明根際放線菌能通過分泌吲哚乙酸(IAA)、產鐵載體、溶磷、固氮等方式提供植物可利用的營養物質促進植物生長，同時通過產具有抗菌的活性物質以及產幾丁質酶、纖維素酶和蛋白酶等拮抗病原微生物，提高植物的抗逆性[5]。此外，大多數放線菌是能產生孢子的，這些孢子均具有較強的抗逆性，能在不利的環境下長期存活。因此，本研究以涼山煙區烤煙根際土壤為研究對象，分離烤煙根際土壤中的放線菌，并研究各菌株的促生和抗菌功能，篩選出具有應用前景的菌株資源。

1 材料與方法

1.1 試驗地點和材料

試驗于2019年6月在冕寧植煙區進行，其試驗地貌類型以山地為主，土壤類型為紅壤，基本理化性質：pH 5.6，有機質23.79g/kg，堿解氮、有效磷、速效鉀含量分別為53.55mg/kg，41.5mg/kg，172mg/kg，烤煙品種為云煙87。分別確定2～3個代表性煙田，在每個代表性煙田中采集旺長期4～6顆健康煙株，將煙株從煙田中小心拔出，輕輕抖掉根系上多余的土壤(非根際土壤)后，將煙株放入無菌塑料袋，保存于4℃冰盒中帶回實驗室，立即進行分離。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養基配置 分離培養基[6]：高氏一號，加入制霉菌素30mg/L，重鉻酸鉀30mg/L；選培養基：LB、PDA，菌株純化、活化、保藏培養基：高氏一號培養基。菌株促生作用篩選試劑：IAA顯色液、CAS檢測液、蒙金娜培養基均參考廖萍等[7]方法進行配制。所用試劑為分析純，均購于生工生物工程上海(股份)有限公司。

1.2.2 植物內生放線菌分離、純化、鑒定 將采集到的煙株根部切下，放入裝有無菌水的三角瓶中于180rmp/min的搖床上處理30min收集根際土壤，并作10-1、10-2、10-3梯度稀釋，取100μl懸液均勻涂布于分離培養基上，放入28℃隔水式培養箱內培養。待放線菌長出后，用高氏一號培養基進行菌落純化，并將純化好的菌株保種于ISP4斜面培養基上，4℃保存備用。觀察菌落的外部形態如：氣絲、基絲、產生色素的顏色及擴散方式、有無孢子產生、是否吐水等情況。接種菌株于高氏一事情培養基埋片培養710d，革蘭氏染色后用光學顯微鏡(Zeiss Axio Imager)觀察菌絲形態[8]。

1.2.3 放線菌抗菌活性檢測 指示菌株：青枯雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)，煙草疫霉菌(Phytophthoranicotianae)、煙草赤星病病菌(Alternariaalternata)，由本實驗室自行分離保存。供試放線菌菌株抗菌活性檢測參照李靜等[9]方法進行。

1.2.4 放線菌促生能力檢測 放線菌菌株產IAA能力測定參考GORDON等[10]方法進行，定量測定菌株產鐵載體能力參照SHI[11]的方法進行。溶磷能力檢測：將供試菌株接種到PKO培養基上，每株菌重復3次，置于28 ℃培養7d，觀察有無解磷圈及解磷圈的大小。

1.2.5 放線菌對煙草促生效果分析 以煙草為研究對象，根據促生結果選擇綜合效果較好的菌株SA129、SA133進行盆栽實驗以初步探究放線菌對煙草的促生效果。供試土壤采自涼山州冕寧縣典型煙田，每盆裝土約2.5kg。設置3個處理：接菌株SA129，接菌株SCAU133和不接菌株(CK)。采用漂浮盤方法進行烤煙育苗(品種為云煙87)，待長出35片真葉后移栽到盆中，每盆栽煙1株，澆灌約50mL放線菌菌懸液(3.8×108CFU/mL)[12]，CK灌溉50mL無菌水，每個處理3個重復。待煙草生長至旺長期(50～60d)，通過EPSON1680根系掃描儀(Epsn，LongBeach，USA)對煙株根系進行掃描，用WinRhizo2005a根系分析軟件分析[13]，獲得根系總根長、總根表面積、平均根系直徑、根尖數、分支數等形態指標，同時測量煙草植株的株高、莖圍、最大葉長、最大葉寬、有效葉片數、植株鮮重、植株干重、地上部分長度進行測算統計。

1.2.6 代表菌株16S rDNA基因系統發育分析 提取代表菌株DNA[14]，選用細菌16S rRNA基因通用引物(8-27F、1504-1523R)[15]對甘草內生放線菌的16S rRNA基因進行擴增。PCR產物送往生工生物工程上海(股份)有限公司進行測序，測序獲得的16SrRNA基因序列與GenBank數據庫中的已知序列進行BLAST比對，用Clustal X(Version1.81)進行序列的多重比對分析，MEGA 6.0軟件采用鄰(Neighbor-Joining)構建系統進化樹[16]，確定放線菌的分類地位。

1.3 數據處理

試驗數據采用Excel 2013和SPSS 20.0軟件進行分析。

2 結果

2.1 煙草根際放線菌的分離、純化

從煙草根際土壤中共分離獲得23株菌，通過觀察菌株菌絲、孢子形態，及培養特征，如氣生菌絲的顏色、基內菌絲的顏色、色素產生情況等，對分離得到的菌株進行形態學初步鑒定。菌株在顯微鏡下表現出絲狀菌絲和鏈狀孢子絲，為典型的放線菌形態，確定所分離獲得的23株菌均為放線菌。

2.2 煙草根際放線菌抗菌活性篩選

對煙草根際放線菌抗菌活性篩選結果表明，分離出的23株菌株中有56.5%的放線菌對供試的至少一種煙草上常見的病原真菌具有不同程度的抗性(表1)，有5個株菌對供試的3種煙草病原真菌均具有抑菌活性，11個株菌對青枯雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)具有抑菌活性，10個株菌對煙草疫霉菌(Phytophthoranicotianae)具有抑菌活性，7個株菌對煙草赤星病病菌(Alternariaalternata)具有抑菌活性，但不同菌株對不同病原菌的拮抗效果存在差異。以上結果表明，分離自煙草根際的放線菌所產生代謝產物具有多樣性，對煙草常見的病原真菌表現出較好的抗菌活性。

2.3 煙草根際放線菌促生能力

對23株煙草根際放線菌促生功能進行檢測(表1)，測得所有放線菌都能產生IAA，但產IAA的能力有差異，產IAA濃度范圍為10.92～68.15mg/L，菌株SA133和SA129產IAA濃度較高，分別為68.92mg/L和54.92mg/L。將23株菌接種到CAS平板上，所有菌株菌落周圍均出現黃色暈圈，其中菌株SA124、SA129、SA131和SA133產生了2mm以上的水解圈；7個菌株在PKO平板上出現解磷水解圈，且水解圈均小10mm；11個株菌(47.82%)具有產幾丁質酶的能力；菌株SA122、SA123、SA129、SA131和SA133同時具有以上4種促生功能。

表1 煙草根際放線菌抗菌促生活性

2.4 盆栽試驗

根據對23株煙草根際放線菌抗菌和促生功能的分析結果(表2)，菌株SA129和SA133被選作供試菌株，通過盆栽實驗驗證其對煙草是否有促生作用。盆栽試驗結果表明，菌株SA129、SA133和SA129+SA133混菌處理對煙草的生長具有顯著的促進作用(P<0.05)(表3)。與對照組相比，菌株SA129、SA133和SA129+SA133處理后的煙草株高、總根長、總根面積、平均根系直徑、總根體積、總根毛數等指標均顯著高于對照組(P<0.05)，而SA129+SA133混菌處理后的煙草株高、總根長、總根面積、平均根系直徑、總根體積、總根毛數分別為42.49cm、8019.34cm、1385.34cm2、1.734mm、15.13cm3、15472個，其促生效果又顯著高于單菌株處理組，表明分離自煙草根際的放線菌可以促進煙草根系的生長，其中復合菌系對煙草植株生長的促進效果最佳。

表2 煙草植株的根系形態特征

2.5 菌株系統發育分析

用于盆栽試驗的2株菌經16SrRNA基因測序分析后基于16SrRNA基因序列構建N-J系統發育樹(圖1)。菌株SA129和SA133與對應相似性最高的菌株同源性為99%100%，均為鏈霉菌屬(Streptomyces)。

圖1 煙草根際放線菌16S RNA基因序列的系統發育N-J樹

3 討論

放線菌廣泛分布不同的自然生態環境中，種類多，數量大，能產生多種生物活性物質，是一類具有巨大實用價值的微生物資源。已有的研究發現，分離自植物根際的放線菌不僅能產生具有抑菌的活性物質，還能分泌植物生長調節劑促進植物的生長和抑制植物病害的發生[17-18]。煙草根際土壤中分布著大量有益微生物類群，有關根際細菌的分離促生效果已有相關報道[19-22]，但有關煙草根際放線菌的研究卻鮮有報道僅見羅文建等[23]從煙草根際中分離獲得了對青枯雷爾氏菌具有拮抗作用的放線菌。

本研究對分離自煙草根際土壤的23株放線菌進行促生功能評價，結果表明，所有放線菌菌株均能分泌IAA和產鐵載體的能力，30%的菌株具有溶磷能力，47.83%的菌株具產幾丁質的能力。此外，23株供試菌中有56.5%的放線菌對供試的至少一種煙草上常見的病原真菌表現出抗性，其中有21.7%的菌株對3種病原菌均有拮抗效果，表明在烤煙根際土壤中蘊藏著豐富的具有促生拮抗功能的放線菌資源。

已有的研究結果表明，接種微生物菌劑改良土壤，維持根際微生物區系平衡，提高土壤肥力，增強作物抗逆性，提升作物產量和品質，特別是接種復合菌劑可充分發揮各菌株的優勢，提升接種效果，促生抗病效果更佳[9,24-25]。劉春菊等[26]從煙草根際土壤分離獲得具有溶磷、抑菌、促生效果好的菌株CT45-1與草酸青霉QM-10混合施用均能提高烤煙對營養物質的吸收，改善烤煙農藝性狀，提高煙葉產量和品質，并在一定程度上提高煙株的抗病性。吳秉江等[27]從煙株根際篩選出兩株生防細菌，接種烤煙后可誘導煙株產生系統抗性(ISR)，增強對病害的防御能力，能有效的防治煙草黑脛病。徐同偉等[28]從黑脛病煙株的根際土壤中獲得了兩株對煙草黑脛病具有較好防治效果的芽孢桿菌，盆栽實驗結果表明接種生防菌株后對烤煙生長具有明顯促生作用，其中復合菌系對煙草黑脛病的防治效果優于單菌。本研究也得到了相似的研究結果，試驗中所篩選到的促生拮抗綜合效果較果的放線菌菌株SA129、SA133和SA129+SA133接種煙苗盆栽實驗結果表明，單菌處理和混菌處理對煙草生長均具有促進作用，處理后的煙草在株高以及根的生長水平上都顯著高于對照組，而混菌處理的效果又顯著高于單菌處理。導致單菌和混合菌接效果差異可能的原因是一方面可能是不同菌株在土壤中的定殖能力及促生機制不同，將多種菌株復合后，增加了接種菌在土壤中定殖效率，同時復合菌兼具IAA、鐵載體、溶磷和產幾質酶的促生活性和對煙草常見病原菌的抑制作用，這些促生抗菌特性不同程度的刺激和調節植物生長，能通過菌株間的協同作用增加植物對土壤中營養物質的吸收和利用，又提高煙草的抗病性，通過多種途徑協同作用促進植物生長，進而達到促生煙草生長的效果[29-30]。因此，放線菌SA129+SA133復合菌系在促進煙草植物生長方面具有一定的應用前景，拓寬了烤煙抗病促生菌種資源的來源，為煙草專用微生物肥料的開發提供了菌種資源和理論依據。

4 結論

從煙草根際土壤中分離獲得了23株放線菌，通過進一步對菌株抗菌促生活性的篩選，獲得了具有較好抗菌促生效果的兩株鏈霉菌菌株SA133和SA129。煙草接種SA133和SA129菌株后，其株高、總根長、總根面積、平均根系直徑、總根體積、總根毛數等指標均顯著高于未接種處理組，且SA129+SA133混菌處理組顯著高于單菌處理組。試驗結果表明，SA133和SA129具有抗菌、溶磷以及產IAA、鐵載體和幾丁酶的能力，能促進煙草的生長，具有較好的應用前景。