人染色體端粒酶基因、TCT結合HPV檢測用于宮頸組織病變的診斷價值

靳夢杰，胡 倩，李 強，吳 輝

宮頸癌為女性生殖系統惡性腫瘤疾病，嚴重危害女性身體健康，全球每年約50萬新發病例，其中14萬出現在中國，占全球新發病例28%。相比于發達國家，發展中國家宮頸癌病死率和發病率都高，因此，選取有效方式進行早期預防、控制十分重要[1，2]。近年，我國女性子宮頸癌篩查研究工作逐步深入，子宮頸癌預后狀況得到顯著改善，選取有效方式擴大篩查范圍，提升疾病篩查特異度和敏感度為疾病防治的關鍵。文獻[3]報道：宮頸癌和人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染有關，其中HPV18、HPV16為最常見類型，且也和人染色體端粒酶(human chromosome telomerase, hTERC)基因異常有一定關系。現階段常用宮頸癌篩查方式為液基薄層細胞檢測(liquid based thin layer cell assay，TCT)、HPV，之后隨著分子病理學技術持續發展，hTERC基因診斷技術也被應用于臨床疾病診斷[4]。本研究旨在探討hTERC基因、TCT結合HPV檢測用于宮頸組織病變的診斷價值。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2019-09至2020-11我院收治的宮頸組織病變篩查患者150例，年齡24～61歲，平均(35.19±2.20)歲。以病理學作為金標準，可分為炎癥29例，宮頸癌前病變(cervical intraepithelial neoplasias, CIN)1、2、3級(依次為37例、42例、30例)，浸潤癌12例。納入標準：(1)接受篩查之前無性生活；(2)未進行陰道沖洗或者盆浴；(3)處于非月經期和妊娠期；(4)未接受子宮切除術。排除標準：(1)近期接受宮頸手術；(2)有盆腔疾病放射治療史；(3)合并畸形陰道炎。

1.2 方法

1.2.1 取材 清洗宮頸分泌物，使用窺陰器充分暴露宮頸，使用無菌干棉球擦洗宮頸表面分泌物，使用專用積液細胞學檢查毛刷置于宮頸鱗狀上皮細胞和柱狀上皮交接位置進行細胞刷取，主要以宮頸外口為中心，以順時針方向旋轉3周，進而取出宮頸刷，之后將細胞裝于保存液小瓶內，一份樣本進行TCT檢測，另一份樣本進行hTERC基因檢測。在進行標本采集時需嚴格避免月經期前后3 d。采集標本過程中發生出血時需清洗好棉簽將宮頸擦洗干凈后繼續采集。采集細胞前要求患者24 h內禁止同房或者盆浴之后進行陰道沖洗、用藥。器械也需干凈整潔，不可使用肥皂水或者乙醇等各種潤滑劑，樣本采集時保存溫度低于4 ℃且保存時間低于7 d。

1.2.2 TCT 主要使用英碩新柏氏膜式液基薄層細胞制作技術，使用ThinPrep2000自動制片機，使用95%乙醇進行固定，巴氏染色，于光鏡下進行閱片。采用2001年國際癌癥協會推薦的TBS(The Bethesda System)分類標準診斷。

1.2.3 HPV 使用第二代雜交捕獲實驗檢測，并通過免疫學技術，化學發光放大基因信號微孔板測量病毒，HPV-DNA負荷率≥1.0 ng/L可判定為陽性。

1.2.4 hTERC基因 TCT涂片、HR-HPV檢測后剩余液體離心處理。hTERC位點擴增檢測試劑盒依據熒光原位雜交技術進行刮片、預處理、變性、雜交、洗滌。單個間期細胞核內紅色、綠色信號各兩個為正常，綠色、紅色信號多于或少于兩個可判定為擴增異常陽性。

1.2.5 陰道鏡和病理診斷 其中三種不同診斷方式任意方式顯示為陽性，則需接受陰道鏡活檢。診斷為宮頸癌、宮頸上皮瘤變時判定為宮頸惡性病變。病理切片至少由兩名病理科醫師進行閱片，兩名醫師結果判定一致之后方可作為最終判定結果，必要時請上級聯合會診。

1.3 觀察指標 對于兩種方式聯合診斷，一項為陽性則可判定為陽性。對比不同分型患者TCT診斷結果，其中主要分析：意義不明確的非典型鱗狀細胞(atypical squamouscells of undP.termined significance，ASC-US)、未見上皮內細胞病變(no intraepithelial cell lesions were found，NILM)、低度鱗狀上皮內病變(low grade squamous intraepithelial lesion，LSIL)、高度鱗狀上皮內病變(high grade squamous intraepithelial lesion， HSIL)。計算各種檢查方法單獨及聯合診斷宮頸惡性病變(癌前病變和浸潤癌)的敏感度、特異度和符合率等指標。敏感度(%)=真陽性人數/(真陽性人數+假陰性人數)×100%；特異度(%)=真陰性人數/(真陰性人數+假陽性人數)×100%；符合率(%)=符合例數/總例數×100%。

2 結 果

2.1 各病理類型下TCT檢查結果 炎癥患者中5例出現ASC-US；CIN1中ASC-US 9例，LSIL 22例，HSIL 4例；CIN2、CIN3及浸潤癌均未有NILM，浸潤癌只有LSIL和HSIL，且HSIL占83.3%(表1)。

表1 宮頸組織病變篩查患者各病理分型下TCT診斷結果 (n；%)

2.2 各病理分型下HPV、hTERC基因表達、TCT及聯合檢查結果 hTERC基因的陽性表達率隨細胞學分級的遞增(炎癥、CIN1、CIN2、CIN3、浸潤癌)而增高，HPV和TCT陽性率呈同樣趨勢(表2)。

表2 宮頸組織病理分型下HPV、hTERC基因表達、TCT及聯合檢測結果 (n；%)

2.3 診斷宮頸惡性病變的敏感度、特異度指標 HPV+TCT、HPV+hTERC進行診斷時特異度和敏感度等指標顯著高于單一一種方式診斷，單用一種檢測方法時，TCT的敏感度和特異度最高，聯合兩種檢測方法時，HPV+hTERCd的敏感度和特異度最高(表3)。

表3 宮頸惡性病變幾種診斷方式的敏感度和特異度比較 (%)

3 討 論

宮頸癌為婦科常見惡性腫瘤疾病，同時也為全球女性發病率僅低于乳腺癌的惡性腫瘤疾病，近年宮頸上皮內瘤變、宮頸癌發病率呈年輕化趨勢，尤其是35歲之下女性，發病人數可占總發病的20%左右[5-7]。現階段研究認為宮頸癌發生和發展為量變到質變的過程，因此疾病早期治療逐步得到重視[8]。依據美國癌癥學會統計2002年宮頸癌患者5年內生存率發達國家為61%，發展中國家則為41%，早期宮頸癌手術患者則可達到80%～90%[9]。宮頸癌患者癌前病變以及早期癌患者盡早篩查可有效預防、治療宮頸癌進而可有效提升患者生存質量[10，11]。

現階段國內外多數研究已經把HPV以及宮頸細胞涂片作為常規宮頸病變篩查的重要方式，陰性患者3年時間內出現CIN Ⅲ病變風險較高，現階段我國普遍使用HPV、TCT、hTERC基因不同篩查方式進行診斷[12-14]。HPV作為常規宮頸病變篩查方式，常和宮頸細胞涂片聯合使用，診斷為陰性患者出現宮頸病變的風險極小，也為現階段我國常用的篩查方式。

現階段已有多數醫院將TCT作為宮頸癌篩查的重要方式，認為此種疾病篩查方式有敏感度、特異度高的特點。細胞學檢查主要問題在于僅進行形態分析，所得細胞多為表層，深層獲取較為困難，因此TCT檢測時漏診率較高，且在閱片過程中多數情況需要醫務人員自主篩查。也有研究提出TCT異常和HPV感染之間雖然關系密切，但作為檢測手段自身存在假陽率、假陰率過高的問題[15]。

對宮頸癌分子遺傳學調查時發現，宮頸上皮細胞突變為癌細胞過程中需要特定基因組產生改變，其中主要為3號染色體長臂擴增。其中hTERC即為3號染色體長臂參與腫瘤惡化的重要原因。有研究提出，3q26異常擴增和浸潤癌及HSIL之間有重要關系[16]。為有效提升宮頸癌前病變疾病診斷符合率，本研究也采用hTERC基因檢測方式，將其用于疾病篩查。本研究結果提示，hTERC檢測陽性率可隨著患者細胞異常等級遞增而提升，其中hTERC基因表達檢測時：炎癥組陽性7例、CIN1組陽性10例、CIN2組陽性26例、CIN3組陽性22例、浸潤癌陽性9例，hTERC聯合HPV或HPV聯合TCT檢測陽性率顯著高于單獨TCT及HPV。該研究結果也說明hTERC基因異常擴增患者宮頸上皮細胞惡性病變可能性較高，其中hTERC基因異常可作為宮頸癌前病變患者發展為浸潤癌的重要指標[17]。文獻[18]也表明，hTERC基因可極大降低細胞學假陽性率，將其作為細胞學檢查重要補充手段。

多數研究認為，端粒酶功能異常為染色體不穩定的重要原因，主要處于染色體3q26區域hTERC基因編碼端粒酶RNA模板，可通過反轉錄的方式合成DNA至染色體末端，進而維持端粒長度穩定性，多數正常體細胞以及組織內端粒酶均屬于陰性，當端粒酶被激活之后，hTERC則會出現過度表達，維持端粒長度，進而使得細胞可獲得無限增殖能力，進而引發腫瘤[19]。有研究證實，隨著宮頸癌患者疾病嚴重程度逐步增大，hTERC基因表達則會逐步提升，因此可認定hTERC基因于宮頸癌發展過程中有重要作用，進而為檢測hTERC基因篩查提供理論依據[20]。HR-HPV感染為宮頸癌主要原因，但較多患者感染時間短暫，一年左右可被免疫功能清除[21，22]。感染后從亞臨床至腫瘤需10年時間，當患者處于潛伏期接受TCT檢測時便無法檢測到病變細胞，但依然可檢測到HPV。隨著HPV加劇，當細胞形態學出現變化時，TCT檢測則會發現異常細胞，隨著HPV持續感染，則會引發宮頸癌前病變，此階段HPV特異度較低，假陽性率較高[23]。TCT和HPV聯合篩查時，則可有效提升診斷特異度、敏感度，也可有效克服單一篩查時問題。雖然癌前病變患者可攜帶HPV，但僅有少量患者會發展為宮頸癌[24]。TCT檢測時，輕度細胞學異常、非典型增生多出現于年輕女性，病變較輕患者檢出率較低，因此可知TCT和HPV均有自身問題。

宮頸癌患者發病的基礎性病因為高危型HPV持續感染，多數感染患者憑借自身免疫力可于8個月自然將HPV病毒清除，僅有少部分患者會持續感染HPV病毒，最終疾病也將發展為CINⅡ～Ⅲ，嚴重情況甚至發生宮頸浸潤癌。本研究顯示：高危HPV感染所引發的疾病明顯多于HPV陰性患者，兩者之間有明顯差異，但單純使用HPV進行檢測時敏感度則會受到影響。從本研究提示，HPV+hTERC聯合診斷時符合率、敏感度、特異度最高，證明兩種方式聯合診斷時對于宮頸癌患者不同疾病診斷階段均高于單一一種方式檢測。對于HPV+TCT診斷結果和HPV+hTERC聯合診斷結果進行對比分析時發現，采用HPV+hTERC診斷時符合率更高，此種情況和hTERC診斷時優勢更為顯著有關，同時也和兩種方式聯合診斷時更為互補有關，因此可知在疾病篩查時可推廣HPV+hTERC兩種方式聯合。

綜上所述，TCT、HPV、hTERC基因聯合診斷可有效判定宮頸組織病變狀況，進而為疾病預防提供指導，其中HPV+hTERC聯合診斷時符合率、敏感度最高。