環指蛋白187過表達后對人腦膠質瘤細胞U87的影響

董俊強，裴美娟，黃生炫，李學文，滕 川

腦膠質瘤是一種中樞神經系統起源的最常見的惡性腫瘤，占顱內腫瘤的40%～50%，因其進展快、預后差，手術切除、放療及化療效果均欠佳，一直是困擾人類健康的難題[1,2]。膠質瘤高侵襲性的特點，是導致傳統治療方案失敗的主要原因[3]，因此，探究膠質瘤侵襲潛在的機制是當前研究的熱點。隨著近些年對腦膠質瘤的深入研究，越來越多的腦膠質瘤靶點和生物標志物被發現[4]。最近環指蛋白187(ring finger protein 187，RNF187)進入研究人員的視野并證實，RNF187是一個含RING域的E3泛素連接酶，在肝細胞癌和非小細胞肺癌中過表達，并通過誘導腫瘤細胞上皮-間質轉化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)促進了腫瘤的發展[5,6]。然而，RNF187在膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲中所起的作用，至今仍然沒有研究清楚。本研究試圖探究RNF187對膠質瘤細胞惡性度的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人腦膠質瘤細胞系U87購自上海中科院細胞庫。RNF187過表達腺病毒表達載體AAVrh.10 RNF187與腺病毒衣殼AAVrh.10 Negative購自云舟生物科技(廣州)有限公司。 蛋白抗體RNF187、NLRP3、ASC、GSDMD及GSDME購自美國abcam公司，CCK-8、Trizol及去RNA酶處理的物品購自美國Sigma公司。RT-PCR引物由賽默飛世爾科技(中國)有限公司合成。Tranwell小室、細胞培養板及計數板購自美國康寧公司。 DMEM培養液、胎牛血清、胰酶等細胞培養試劑購自美國Gibco公司。

1.2 細胞培養及轉染 U87細胞在37 ℃和含5% CO2的條件下用含10%胎牛血清、1% 100U/L青/鏈霉素的DMEM 培養液進行常規培養。實驗分3組：對照組、陰性對照組和RNF187過表達組。陰性對照組和RNF187過表達組U87細胞分別加入等滴度純化的腺病毒表達載體AAVrh.10 Negative、AAVrh.10 RNF187，對照組加入等體積PBS，共培養12 h。根據細胞的密度進行換液或者傳代。每次傳代時，加入2.5 μg/ml嘌呤霉素繼續篩選穩定的細胞株，每隔1 d于熒光顯微鏡觀察細胞GFP熒光強度，直至熒光強度無明顯變化，無死亡漂浮的細胞。

1.3 qRT-PCR實驗 使用Trizol試劑盒提取細胞內總RNA，利用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA鏈，利用Real-timePCR試劑盒檢測細胞內各蛋白mNRA的表達，GAPDH作為內參。引物序列見表1。

表1 各蛋白基因引物序列

1.4 CCK-8(Cell Counting Kit-8)增殖試驗 取細胞懸液約100 μl在具有完全培養液的96 孔板中培養至約5×103/孔(37 ℃、5% CO2)。用10 μl 的CCK-8處理后，相同條件下繼續培養2 h，用酶標儀測定各孔在450 nm 處的吸光值。

1.5 細胞克隆形成實驗 梯度倍數稀釋對數生長期的各組細胞懸液，分別接種在培養皿中，培養2～3周。當培養皿中出現肉眼可見的克隆時終止培養。棄上清，4%多聚甲醛固定，吉薩姆染色液染10～30 min。

1.6 Transwell實驗 利用無血清DMEM培養液重懸各組細胞至1×104/ml，取200 μl加入Transwell小室中，并將盛有細胞懸液的Transwell小室置于含有培養液的實驗孔中培養24 h；取出Transwell小室，PBS清洗后，利用棉簽擦去小室薄膜上層細胞后，結晶紫染色薄膜下層細胞后，置于顯微鏡下計數拍照。

1.7 Westernblot檢測 取轉染后72 h的各組細胞，破碎后提取蛋白質。使用BCA蛋白質測定試劑盒測量每個樣品的總蛋白質量。各組提取等量蛋白50 μg，使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質，半干轉移至PVDF膜。10%脫脂奶粉4 ℃封閉1 h，然后在含一抗的10%脫脂奶粉的TBST緩沖液過夜：兔單抗NLRP3抗體(1∶1000)、兔單抗ASC抗體(1∶1000)、兔單抗GSDMD抗體(1∶1000)、兔單抗GSDME抗體(1∶1000)、兔單抗RNF187抗體(1∶1000)、兔單抗GAPDH抗體(1∶1000)。TBST沖洗4次，然后將膜與辣根過氧化物酶山羊抗兔(1∶10 000)二抗孵育2 h，TBST沖洗4次，ECL plus用于信號檢測，Image J軟件用于定量分析。

2 結 果

2.1 轉染后U87細胞過表達RNF187 與對照組[(1.03±0.12)，(0.35±0.11)]和陰性對照組[(1.08±0.15)，(0.40±0.08)]相比，RNF187組的RNF187 mRNA及蛋白表達水平[(2.33±0.41)，(0.78±0.06)]明顯升高(P<0.05)，而空白對照組和陰性對照組之間差異無統計學意義(P>0.05，圖1)。光鏡下可見RNF187組膠質瘤細胞腫脹膨大，細胞數目明顯增多，細胞之間連接疏松，并有許多氣泡狀突出物(圖2)。

圖1 腦膠質瘤RNF187蛋白表達水平

圖2 腦膠質瘤RNF187對U87細胞的影響(×200)A.對照組；B. Negative組；C. RNF187過表達組

2.2 RNF187過表達促進U87細胞增殖、遷移和侵襲 CCK-8實驗結果顯示，對照組與陰性對照組細胞增殖率[(1.45±0.11)vs.(1.43±0.13)]差異無統計學意義，RNF187過表達組細胞增殖率(2.24±0.16)高于其他兩組(P<0.05)?？寺⌒纬蓪嶒灲Y果顯示，對照組和陰性對照組細胞克隆數[(119.3±22.4)vs.(121.5±18.7)]差異無統計學意義，RNF187過表達組細胞的克隆數(313.4±22.9)高于其他兩組，差異有統計學意義(P<0.05)。 transwell實驗結果顯示，對照組和陰性對照組相比穿膜細胞數[(84.3±11.5)vs.(79.5±10.2)]差異無統計學意義，而RNF187組的U87穿膜細胞數(226.4±12.6)較其他兩組升高，差異有統計學意義(P<0.05，圖3)。

圖3 腦膠質瘤RNF187過表達對U87細胞transwell實驗的影響(×200)A.對照組；B. 陰性對照組；C. RNF187過表達組

2.3 RNF187過表達促進U87細胞發生焦亡 RT-PCR和Western blot實驗結果顯示，對照組和陰性對照組相比焦亡相關mRNA及蛋白(NLRP3、ASC、GSDMD和GSDME)差異均無統計學意義，與對照組和陰性對照組相比，RNF187組焦亡相關mRNA及蛋白(NLRP3、ASC、GSDMD和GSDME)表達水平均明顯升高(P<0.05，圖4、表2、表3)。

圖4 腦膠質瘤RNF187過表達對焦亡蛋白的影響

表2 腦膠質瘤焦亡蛋白相對表達量

表3 腦膠質瘤焦亡蛋白mRNA相對表達量

3 討 論

膠質瘤是最危及生命的原發性腦腫瘤之一，其發生、發展是一個涉及抑癌基因和致癌基因間平衡的多步驟過程，受到多基因的調控[7]，膠質瘤導致患者死亡的主要原因是其侵襲和轉移[8]。在這項研究中發現，與正常的腦膠質細胞組織相比，RNF187在膠質瘤細胞系U251、U87、A172、LN229和SHG-44中過表達，其中在U87細胞株表達水平最高。通過cDNA轉染U87細胞，本研究提出過表達RNF187的膠質瘤細胞在體外具有高度侵襲和轉移的潛能?，F在，公認的是泛素化在翻譯后蛋白質修飾中起著重要作用，調節著細胞許多的關鍵過程，如細胞周期、細胞凋亡和DNA修復[9]。因此，泛素化參與翻譯后修飾，并在真核生物的不同生理和病理過程中起著至關重要的作用，泛素功能障礙與多種腫瘤的發生和發展有關[9]，包括肺癌[10]、大腸癌[11]、肝細胞癌[12]和膠質瘤。上述數據表明異常的RNF187可能是腫瘤發展的重要助推器。

本研究發現，RNF187過表達顯著提高焦亡相關蛋白(NLRP3、ASC、GSDMD、GSDME)的表達水平，證明RNF187過表達能夠促進膠質瘤細胞焦亡的發生。細胞焦亡與腫瘤的發生發展有關，是一種由gasdermin 蛋白家族介導的程序性死亡[13]。最近有研究表明，細胞焦亡促進早期腫瘤的發生[14]。此外，RNF187基因敲除被揭示通過抑制激活蛋白-1(AP-1)相關基因的轉錄來抑制細胞增殖，RNF187的過表達激活連環蛋白(Wnt)和Ras通路，從而加速結腸上皮中腫瘤的形成[15]。有研究表明，泛素E3連接酶調控NLRP3表達，NLRP3的組裝導致caspase-1的激活，觸發細胞因子白細胞介素(IL)-1β和IL-18的釋放，激活細胞焦亡過程[16]。Wnt可以通過增加NLRP3和ASC之間的聯系來促進NLRP3炎性小體激活[17]，并且多項研究表明NLRP3具有調控EMT的作用[18]。細胞焦亡還可促使腫瘤細胞轉移，活化的NLRP3炎性小體可促進腫瘤細胞的生長增殖[19]。凋亡的典型特征之一是由GSDMD引起的質膜孔的形成[20]。以上研究表明RNF187過表達可以激活細胞焦亡途徑，這可能是促進膠質瘤細胞增殖、侵襲的關鍵。

總之，RNF187可通過細胞焦亡相關分子通路作用于腦膠質瘤細胞促進其惡性演進。