三種中獸藥產品中黃柏薄層色譜無苯展開系統研究

安鵬麗，陳 靜，李金超，馮亞文，郭 莉，張 娜，楊彥超，李 樓，武俠均

(1.保定冀中藥業有限公司，保定 071500；；2.河北省獸藥監察所，石家莊 050035；3.唐山市食品藥品綜合檢驗檢測中心，河北唐山 063000)

三黃散、公英青藍合劑、公英青藍顆粒三個產品是畜牧養殖行業的常用產品，其標準收錄于2017年版《獸藥質量標準》(中藥卷)[1]。三個產品組方都含有黃柏，在黃柏的薄層色譜鑒別方面，展開劑都使用了苯-乙酸乙酯-甲醇-異丙醇-濃氨試液(6∶3∶1.5∶1.5∶0.5)。

薄層色譜法是一種簡便、快速、微量的分析方法，廣泛應用于化學合成、天然藥物的定性鑒別和純度檢驗中。其中，展開系統是決定薄層色譜分離效果的重要因素。苯價格便宜且分離效果好，在多種藥物的薄層鑒別中表現出了優良的性質，但其毒性不容忽視。自職業病實現網絡報告以來，苯引起的急、慢性中毒人數一直位居我國職業中毒首位；2017年國際癌癥研究中心將苯再次列入人類致癌物清單(Ⅰ類)，同時被我國納入《國家高毒物品目錄》[2]。業內對無苯展開劑的研究不在少數。李正國等[3]人曾用甲苯替代苯，對梔子金花丸中的黃連、黃柏進行薄層鑒別；陳藹等[4]對使用苯、甲苯為展開劑的多種中藥材進行了方法改進，取得了較好的成果；朱弘等[5]對黃連解毒散、香薷散、烏梅散的薄層鑒別進行了無苯展開系統研究，證實以環己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙胺(3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1)為展開劑能收到良好的分離效果。

鑒于此，研究針對三黃散、公英青藍合劑、公英青藍顆粒三個常用產品開展了替代苯試劑的薄層鑒別研究，以期找到合適的展開劑，減少苯的使用，保護工作人員，并減少環境污染。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 GoodLook-2000型薄層色譜成像儀，上?？普苌萍加邢薰尽?/p>

硅膠G薄層板，青島海洋化工廠分廠，規格100 mm×100 mm，厚度0.20～0.25 mm，批號2020年07月07日、批號2020年05月08日。

硅膠HSG薄層板，煙臺江友硅膠開發有限公司，規格100 mm×200 mm，厚度0.2 mm±0.03 mmm，批號020191216。

硅膠HSG薄層板，煙臺化學工業研究所，規格200 mm×100 mm，厚度0.25 mm±0.02 mm，批號20200703。

DC-Fertigplatten SIL G-25薄層板，德國MN(MACHEREY-NAGEL)公司，規格10×20 cm，厚度0.25 mm，批號407191。

TLC Silica gel 60薄層板，德國默克公司(Merck KGaA)，規格10 cm×20 cm，批號HX02024426。

玻璃點樣毛細管，華西醫科大學儀器廠生產，內徑0.5 mm。

三黃散、公英青藍合劑、公英青藍顆粒標方樣品及三種產品相應的無黃柏陰性樣品，按照國家現行標準《獸藥質量標準2017年版中藥卷》[1]自制。

鹽酸小檗堿對照品(批號110713-201212)、黃柏對照藥材(批號121510-201807)，購自中國食品藥品檢定研究院。

試劑甲醇、正丁醇、冰醋酸、乙酸乙酯、丁酮、甲酸、乙酸乙酯、環己烷、乙酸乙酯、異丙醇、三乙胺、氨水、正己烷、三氯甲烷均為分析純，水為純化水。

1.2 試驗方法

1.2.1 方法設計 室溫條件下，以硅膠G板為固定相，參照《獸藥質量標準2017年版中藥卷》《中國獸藥典》[6]《中國藥典》[7]中黃柏及鹽酸小檗堿的相關檢測方法，篩選出的4種使用較為廣泛的展開劑組合，對三種產品進行薄層色譜分離。若能篩選出分離效果較好的展開劑，則根據斑點分離度及目標斑點比移植等進一步優化其配比，使其能夠達到最佳的分離效果。若備選項均不能達到有效分離，則另外探索新的試驗方法。篩選的4種展開方法如下：

方法一：正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶2)[1]

方法二：乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶7∶1∶1)[7]

方法三：乙酸丁酯-甲酸-水(14∶5∶5)的上層溶液[7]

方法四：環己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙胺(3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1)，氨蒸氣預飽和20 min[6，8]

1.2.2 樣品前處理

1.2.2.1 三黃散 取三黃散標方樣品0.3 g，加甲醇5 mL，超聲處理10 min，濾過，濾液作為供試品溶液。取不含黃柏的陰性對照樣品，同法制備三黃散陰性對照樣品。

1.2.2.2 公英青藍合劑 取公英青藍合劑標方樣品2 mL，水浴蒸至近干，放冷，加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。取不含黃柏的陰性對照樣品，同法制備公英青藍合劑陰性對照樣品。

1.2.2.3 公英青藍顆粒 取公英青藍顆粒標方樣品5 g，加甲醇5 mL使溶解，濾過，濾液作為供試品溶液。取不含黃柏的陰性對照樣品，同法制備公英青藍顆粒陰性對照樣品。

1.2.2.4 對照藥材與對照品 取黃柏對照藥材0.1 g，加甲醇5 mL，超聲處理10 min，濾過，取濾液作為對照藥材溶液。再取鹽酸小檗堿對照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。

1.2.3 點樣、展開與顯色 分別取三黃散陰性樣品、對照品、對照藥材、三黃散標方供試品溶液各2 μL，公英青藍合劑陰性樣品、對照品、對照藥材、公英青藍合劑標方供試品溶液各1 μL，公英青藍顆粒陰性樣品、對照品、公英青藍顆粒標方供試品溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G板上，按照1.2.1項下設計方法展開，展距8 cm，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。

2 結果與分析

2.1 方法一(正丁醇-冰醋酸-水系統)結果 由圖1可見，以正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶2)為展開劑對三藥進行薄層色譜分離，三黃散與公英青藍合劑分離度不夠，公英青藍顆粒背景模糊，與上下斑點之間輪廓不夠清晰。再者，該方法展開需時較長，展距8 cm約需2～2.5 h，不是首選方法。

A：三黃散展開圖(1.陰性對照；2.鹽酸小檗堿對照品；3.黃柏對照藥材；4.三黃散標方樣品)B：公英青藍合劑展開圖(1.陰性對照；2.鹽酸小檗堿對照品；3.黃柏對照藥材；4.標方樣品)C：公英青藍顆粒展開圖(1.陰性對照；2.鹽酸小檗堿對照品；3.標方樣品)以下均相同圖1 正丁醇-冰醋酸-水系統對三藥分離效果Fig 1 Separation effect for all the three drugs withn-butanol-glacial acetic acid-water system

2.2 方法二(乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水系統)結果 以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶7∶1∶1)為展開劑對三藥進行薄層色譜分離，三黃散的陰性樣品存在干擾，公英青藍合劑與公英青藍顆粒條帶中主斑點與上下的藍色斑點分離度低，該方法不適用。

圖2 乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水系統對三藥分離效果Fig 2 Separation effect for all the three drugs with ethyl acetate-butanone-formic acid-water system

2.3 方法三(乙酸丁酯-甲酸-水系統)結果 由圖3可見，以乙酸丁酯-甲酸-水(14∶5∶5)的上層溶液為展開劑，三黃散與公英青藍合劑陰性樣品不存在干擾，但是公英青藍顆粒在主斑點處存在干擾，三者分離度都較差。

圖3 乙酸丁酯-甲酸-水系統(上層溶液)對三藥分離效果Fig 3 Separation effect for all the three drugs with butyl acetate-formic acid-water system (the upper solution)

2.4 方法四(環己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙胺系統)結果 由圖4可見，以環己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙胺(3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1)為展開劑，三藥分離度尚可，但是三黃散的陰性樣品存在干擾，主斑點與一個紅色斑點重合；4B與4C間對比，可明顯看出該方法對鹽酸小檗堿主斑點的展開效果不穩定，主斑點出現的位置受溫度、濕度及加入氨水的量等多個因素干擾，重現性極差。因此該方法不適用于三種目標產品的薄層分離。

圖4 環己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙胺系統對三藥分離效果Fig 4 Separation effect for all the three drugs with cyclohexane-ethyl acetate-isopropanol-methanol-water-triethylamine system

2.5 方法改進 由于上述四種來自藥典的展開系統未能達到理想的分離效果，后期進行了多種組合的嘗試，最終確定了新的展開系統：正己烷-三氯甲烷-丁酮-乙酸乙酯-甲酸-水(3∶9∶6∶3∶4∶0.5)。該系統對三種藥物的分離效果如圖5。

(使用青島海洋2020年07月07日批次薄層G板)圖5 正己烷-三氯甲烷-丁酮-乙酸乙酯-甲酸-水系統對三藥分離效果Fig 5 Separation effect for all the three drugs with n-hexane-chloroform-butanone-ethyl acetate-formic acid-water system

由圖可見，三黃散、公英青藍合劑、公英青藍顆粒三種藥物使用該展開系統，分離度高，斑點輪廓清晰，效果良好。

除斑點的形態和分離度指標外，比移植Rf也是薄層色譜法的基本定性參數。

比移值Rf=原點到斑點中心的距離/原點到溶劑前沿的距離

當色譜條件一定時，組分Rf是一常數，其值在0～1之間，可用范圍是0.2～0.8，最佳范圍是0.3到0.5。物質不同，結構和性質各不相同，其Rf也不同。因此，利用Rf可以對物質進行定性鑒別[9]。

原點到溶劑前沿的距離即為展距，本試驗中薄層板高10 cm，展距在8 cm，多次重復證實，目標斑點位置距離原點在3.3～5 cm之間，受展開劑飽和時間、溫濕度、不同硅膠板批次的影響稍有變動。計算目標斑點的比移值Rf介于0.41～0.62之間，各斑點之間分布較為均勻，方法穩定。

2.6 方法驗證 以正己烷-三氯甲烷-丁酮-乙酸乙酯-甲酸-水(3∶9∶6∶3∶4∶0.5)為展開劑，對三黃散、公英青藍合劑、公英青藍顆粒的樣品進行薄層色譜分離，分別使用青島海洋2020年5月8日(圖6-1)及2020年7月7日生產的硅膠G板重復試驗，后者分離效果稍好于前者；使用德國默克公司G板HX02024426批次(圖6-2)、德國MN公司G板407191批次(圖6-3)，以及煙臺江友HSG板020191216批次(圖6-4)、煙臺化工HSG板20200703批次(圖6-5)重復，均能達到更好的分離效果。

3 討論與結論

苯屬于一類溶劑，對人體和環境的危害很大，國內外實驗室均已避免使用。2005年版《中國藥典薄層色譜彩色圖譜集》中已經將苯改為甲苯，但該展開系統不穩定，存在重現性差的問題[10]。研究在改進三黃散、公英青藍合劑、公英青藍顆粒三種藥物中黃柏的薄層色譜鑒別展開劑的研究過程中，試驗了多種相關藥物應用的不同展開劑，如使用三氯甲烷-甲醇-濃氨(5∶0.6∶0.3)(苦參藥材鑒別)、二氯甲烷-丁酮-甲酸-水(10∶1∶0.1∶0.1)(布渣葉藥材鑒別)等為代表的展開劑，酸/堿的含量較低，鹽酸小檗堿主斑點滯留在原點不發生移動，但是提高展開劑中酸或堿的含量至10%左右，則目標斑點能夠隨展開劑上行，且經過對比證明，甲酸比乙酸、氨水、三乙醇胺等分離度好。雖然經過幾十次嘗試仍未找到直接可用的展開劑組合，但是發現了這三種產品在分離過程中有共同點：①主斑點的分離需要在酸或堿性環境下進行；②三氯甲烷能夠使主斑點上升到無干擾的高度；③三氯甲烷展開的主斑點形態有拖尾，乙酸乙酯能改善斑點形態；④加入少量水能夠使Rf值適中。

經過嘗試，最終確定了新的展開系統：正己烷-三氯甲烷-丁酮-乙酸乙酯-甲酸-水(3∶9∶6∶3∶4∶0.5)。經過不同溫濕度條件下的多次重復試驗證明，該展開系統分離度高，重現性好，專屬性強，展距8 cm整體耗時在30～40 min；所用試劑均為常規試劑，毒性小，且對飽和時間無嚴格要求，是一種很穩定的展開劑系統。該系統可為三黃散、公英青藍合劑、公英青藍顆粒和其它以鹽酸小檗堿為主要成分的中藥材及成方制劑薄層色譜鑒別提供參考。