ROCK抑制劑對(duì)青光眼術(shù)后瘢痕形成的作用機(jī)制

劉莉莉 招志毅 曾招榮

（廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院柳州市工人醫(yī)院眼科，柳州 545005）

青光眼是由于眼壓升高導(dǎo)致的進(jìn)行性視神經(jīng)損害、視野缺損的一種不可逆的致盲眼病。青光眼的患病人數(shù)較多，在2010年之前全球就已經(jīng)累計(jì)近億人，且呈上升趨勢(shì)[1]。據(jù)相關(guān)報(bào)道，我國(guó)青光眼患者45 歲以上發(fā)病率較高，其中近一半的患者最終發(fā)展為眼盲[2]。藥物在青光眼中期以后便不能控制眼內(nèi)壓水平，此時(shí)需要外部手術(shù)來(lái)進(jìn)行治療，但需要面臨手術(shù)失敗的后果。在手術(shù)失敗后濾過(guò)道愈合的過(guò)程中，血小板與凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)使細(xì)胞的炎癥因子增加，最后形成瘢痕[3]。臨床上一般會(huì)應(yīng)用干擾素等藥物提高手術(shù)成功率，但藥物對(duì)機(jī)體產(chǎn)生危害。Rho 相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶（rho associated coiled coil forming protein kinase，ROCK）是一種細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路分子，其不同的表達(dá)會(huì)影響細(xì)胞發(fā)育。ROCK 抑制劑是可調(diào)節(jié)ROCK 活性的復(fù)合物[4]，有研究者用ROCK 抑制劑治療術(shù)后瘢痕，效果較為明顯[5]，但其作用機(jī)制尚不明確。因此，本研究探討ROCK 抑制劑對(duì)青光眼手術(shù)導(dǎo)致瘢痕的影響，分析其對(duì)瘢痕形成的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

健康大鼠28 只購(gòu)自君科生物公司，鼠齡1～2月，體質(zhì)量200～250 g，常規(guī)飼養(yǎng)，溫度在25.6 ℃左右。

氯霉素眼液（長(zhǎng)春迪瑞公司）；阿托品眼膏（沈陽(yáng)興齊公司）；10-0 尼龍線（東莞博斯蒂公司）；金霉素眼膏（上海通用公司）；ROCK 抑制劑Y-27632（上海澤葉公司）；胰蛋白酶（南寧龐博生物公司）。

1.2 青光眼模型的建立及分組

28 只健康大鼠術(shù)前1 d 采用氯霉素滴眼，均采取右眼為實(shí)驗(yàn)眼。0.15 mL/kg 速眠新注射液肌內(nèi)注射麻醉后，氯霉素沖洗眼結(jié)膜，在右眼鼻上端角膜緣為底部的結(jié)膜瓣，暴露鞏膜，做大小為4 mm×3 mm、深度為1/2 的四方形鞏膜瓣，分離至清亮角膜內(nèi)至少0.5 mm 處，做1 mm×2 mm 大小的小梁組織切除，并做虹膜根部切除；將鞏膜復(fù)位對(duì)合后采用10-0 尼龍線縫合鞏膜瓣，8-0 尼龍線縫合結(jié)膜瓣。術(shù)畢，采用0.5%金霉素眼膏和阿托品眼膏涂抹患眼，術(shù)后連續(xù)3 d 氯霉素眼藥水點(diǎn)眼1～2 次，每次1～2 滴。28 只青光眼模型分為2 組，模型組14 只：青光眼模型大鼠常規(guī)飼養(yǎng)；RR 組14只：在青光眼模型建立成功24 h 后，進(jìn)行玻璃體腔注射ROCK 抑制劑Y-27632（30 μmol/L）5 μL，15 d 后10%水合氯醛（500 mg/kg）麻醉大鼠，取右眼眼球放置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 瘢痕組織成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)

取各組大鼠濾過(guò)道瘢痕組織，置于培養(yǎng)皿內(nèi)，PBS 漂洗2 次，加入適量胎牛血清（fetal calf serum，F(xiàn)CS），將瘢痕組織剪碎，篩網(wǎng)過(guò)濾，將含組織塊的FCS 混合液均勻覆蓋于50 mL 培養(yǎng)瓶接種面，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶使組織貼壁面朝上。貼壁4 h后加入含有雙抗及10%FCS 的DMEM 培養(yǎng)液，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，每周換液2～3 次，待細(xì)胞融合后，用0.125%的胰蛋白酶消化，以1∶2 傳代，取傳至第4～9 代的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 MTT 法測(cè)定瘢痕組織中成纖維細(xì)胞增殖

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的成纖維細(xì)胞，用胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)板，常規(guī)培養(yǎng)24 h。采用酶標(biāo)儀于490 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（A490）值，計(jì)算成纖維細(xì)胞的抑制率。

1.5 RT-PCR 檢測(cè)濾過(guò)道瘢痕組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforing growth factoe-β1，TGF-β1）、ROCK、α 平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）mRNA 表達(dá)

將術(shù)后28 d 的2 組大鼠濾過(guò)道瘢痕組織加入胰蛋白酶消化，提取細(xì)胞重懸液，沖洗，置入無(wú)菌試管中，采用TRIzol 試劑提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為DNA，對(duì)TGF-β1、ROCK、α-SMA mRNA 進(jìn)行擴(kuò)增，β-actin 為內(nèi)參，引物序列見(jiàn)表1。PCR 反應(yīng)條件：98 ℃6 min，98 ℃28 s，75 ℃30 s，80 ℃4 min，總計(jì)55 個(gè)循環(huán)，用2－△△Ct法計(jì)算2 組大鼠濾過(guò)道瘢痕組織中基因的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 引物序列

1.6 免疫組織化學(xué)檢測(cè)濾過(guò)道瘢痕組織白介素（interleukin，IL)-1β（IL-1β）、α-SMA 表達(dá)

2 組大鼠于第7 周斷頭處死，取眼部術(shù)后瘢痕組織脫蠟、常規(guī)切片，胰蛋白酶消化修復(fù)抗原，H2O2去除過(guò)氧化物酶活性，加 IL-1β、α-SMA 一抗、生物素標(biāo)記二抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉素工作液，DAB 顯色，蒸餾水終止顯色；脫水，透明，封片，光學(xué)顯微鏡下觀察，以組織中出現(xiàn)棕黃色染色為陽(yáng)性表達(dá)。每組任意選取6 張石蠟切片，拍照記錄。

1.7 免疫印跡檢測(cè)濾過(guò)道瘢痕組織IL-1β、IL-6、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothlial growth factor，VEGF）、α-SMA 蛋白的表達(dá)

將青光眼術(shù)后瘢痕組織進(jìn)行裂解，并提取蛋白，并對(duì)蛋白的濃度進(jìn)行測(cè)量，分裝后，保存在-20℃的環(huán)境中。將提取出的蛋白溶液和緩沖溶液按照4∶1 比例混勻，煮沸使蛋白質(zhì)變性，將蛋白樣品（50 μg）轉(zhuǎn)移PVDF 膜上，脫脂奶粉封閉1 h。加入一抗（1∶150）稀釋后孵育過(guò)夜，TBS 漂洗3 次，每次10 min，最后加入二抗常溫孵育。取出PVDF膜，每隔10 min 漂洗1 次，共3 次，DAB 顯色后照相。嚴(yán)格按照IL-1β、IL-6、VEGF 試劑盒說(shuō)明操作，計(jì)算各蛋白表達(dá)含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ROCK 抑制劑對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞增殖的影響

MTT 法測(cè)定結(jié)果顯示，模型組成纖維細(xì)胞的抑制率為60.12%±5.21%，低于RR 組的抑制率91.12%±0.94%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明ROCK 抑制劑可抑制瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖。

2.2 術(shù)后濾過(guò)道瘢痕組織TGF-β1 mRNA、ROCK mRNA、α-SMA mRNA 的表達(dá)

RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，建模組大鼠濾過(guò)道瘢痕 組 織TGF-β1 mRNA、ROCK mRNA、α-SMA mRNA 的表達(dá)均顯著高于RR 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表2）。

表2 濾過(guò)道瘢痕組織TGF-β1 mRNA、ROCK mRNA、α-SMAmRNA 的表達(dá)（n=14，±s）

表2 濾過(guò)道瘢痕組織TGF-β1 mRNA、ROCK mRNA、α-SMAmRNA 的表達(dá)（n=14，±s）

*P<0.05 vs 模型組

組別 TGF-β1 mRNA ROCK mRNA α-SMA mRNA模型組 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 RR 組 0.35±0.01* 0.27±0.03* 0.23±0.02*

2.3 濾過(guò)道瘢痕組織IL-1β、α-SMA 陽(yáng)性表達(dá)

免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，RR 組大鼠濾過(guò)道瘢痕組織中IL-1β、α-SMA 的陽(yáng)性表達(dá)低于模型組（P<0.05），說(shuō)明ROCK 抑制劑可抑制IL-1β、α-SMA 的陽(yáng)性表達(dá)（表3，圖1）。

表3 濾過(guò)道瘢痕組織IL-1β、α-SMA 的陽(yáng)性表達(dá)（n=14，±s，%）

表3 濾過(guò)道瘢痕組織IL-1β、α-SMA 的陽(yáng)性表達(dá)（n=14，±s，%）

*P<0.05 vs 模型組

組別 IL-1β α-SMA模型組 30.12±2.85 60.15±4.21 RR 組 22.47±1.04* 34.26±0.03*

圖1 大鼠濾過(guò)道瘢痕組織 IL-1β（A1、B1）、α-SMA（A2、B2）陽(yáng)性表達(dá)，免疫組織化學(xué)顯色，×400

2.4 濾過(guò)道瘢痕組織IL-1β、IL-6、VEGF、α-SMA蛋白表達(dá)

免疫印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組大鼠濾過(guò)道瘢痕組織IL-1β、IL-6、VEGF、α-SMA 的表達(dá)水平高于RR 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明ROCK 抑制劑可使IL-1β、IL-6、VEGF、α-SMA的表達(dá)降低（表4、圖2）。

表4 濾過(guò)道瘢痕組織IL-1β、IL-6、VEGF、α-SMA蛋白的表達(dá)（n=14，±s）

表4 濾過(guò)道瘢痕組織IL-1β、IL-6、VEGF、α-SMA蛋白的表達(dá)（n=14，±s）

*P<0.05 vs 模型組

組別 IL-1β IL-6 VEGF α-SMA模型組 1.42±0.18 1.30±0.13 1.26±0.11 1.56±0.21 RR 組 0.32±0.03* 0.41±0.05* 0.35±0.04 0.47±0.07

圖2 大鼠濾過(guò)道瘢痕組織IL-1β、IL-6、VEGF、α-SMA 蛋白表達(dá)免疫印跡電泳圖

3 討論

青光眼濾過(guò)道術(shù)失敗后，手術(shù)區(qū)可形成瘢痕，瘢痕的形成與成纖維細(xì)胞的增殖以及TGF-β1、VEGF 的異常表達(dá)有著密切的聯(lián)系。近年來(lái)的研究表明，ROCK 抑制劑可降低成纖維細(xì)胞增殖，改善血流動(dòng)力學(xué)，增加眼部血供，減少炎癥因子的表達(dá)，抑制眼部神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，加速神經(jīng)元生長(zhǎng)，對(duì)眼部神經(jīng)起到一定保護(hù)作用[6-9]。因此，抑制瘢痕形成在青光眼濾過(guò)術(shù)治療中具有重要作用。

本研究結(jié)果表明，ROCK 抑制劑可抑制青光眼術(shù)后瘢痕成纖維細(xì)胞增殖。青光眼濾過(guò)性手術(shù)后，由于血-房水屏障的破壞以及手術(shù)區(qū)的炎癥反應(yīng)，使得成纖維細(xì)胞大量增殖，導(dǎo)致結(jié)膜下組織纖維化和濾過(guò)道瘢痕形成。蔣鵬飛等[10]研究表明，青光眼有效成分通過(guò)抑制膠原纖維、成纖維細(xì)胞特異性蛋 白1（fibroblast-specific protein 1，F(xiàn)SP-1）、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor，CTGF）的表達(dá)，降低肌成纖維細(xì)胞的增殖，從而減少濾過(guò)道瘢痕組織的增生。ROCK 抑制劑具有抗炎、抗瘢痕等作用，可以特異性抑制酪氨酸蛋白激酶（tyrosine protein kinase，TPK），阻礙細(xì)胞膜受體與血小板源性生長(zhǎng)因子結(jié)合，降低成纖維細(xì)胞增殖率[11]。RKI-1447 是一種高效的ROCK 抑制劑。孫琳[12]研究表明，RKI-1447 可有效抑制外源性TGF-β1 誘導(dǎo)的大鼠尿道成纖維細(xì)胞的增殖、表型轉(zhuǎn)化、遷移和細(xì)胞外基質(zhì)成分合成等細(xì)胞生物學(xué)變化。本研究與上述研究結(jié)果一致。

本研究結(jié)果表明，ROCK 抑制劑可抑制TGF-β1 mRNA、ROCK mRNA、IL-1β、IL-6、VEGF、α-SMA 的表達(dá)。TGF-β1 主要通過(guò)激活成纖維細(xì)胞內(nèi)Smad 家族蛋白3（Smad3）啟動(dòng)膠原基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，促進(jìn)膠原形成，使成纖維細(xì)胞增加，進(jìn)而使瘢痕形成[13]。歐陽(yáng)云等[14]通過(guò)對(duì)兔進(jìn)行研究顯示，青光眼可降低TGF-β/Smad 細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制濾過(guò)道瘢痕形成。ROCK 是蛋白激酶的一種，接受RhoA 信號(hào)后，參與氨基酸磷酸化,從而使其表達(dá)升高，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。根據(jù)有關(guān)研究表明RhoA/ROCK 信號(hào)在青光眼瘢痕中表達(dá)升高，表示RhoA/ROCK 參與了瘢痕發(fā)生發(fā)展[15]。陳曉柳等[16]研究表明血栓通、絲裂霉素等可以通過(guò)抑制ROCK的表達(dá)進(jìn)而抑制成纖維細(xì)胞的活性，從而阻礙瘢痕的形成。IL-1β 是由成纖維細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，增加炎癥反應(yīng)，使術(shù)后愈合時(shí)間延長(zhǎng)及成纖維細(xì)胞增加。張康玉等[17]通過(guò)對(duì)大白兔建立青光眼術(shù)后瘢痕研究表明，可通過(guò)抑制IL-1β 進(jìn)而抑制成纖維細(xì)胞的增殖，從而抑制瘢痕的產(chǎn)生。IL-6 是一種免疫調(diào)節(jié)因子，在多種纖維化疾病中可通過(guò)對(duì)靶細(xì)胞的調(diào)控進(jìn)而抑制成纖維細(xì)胞的增殖，阻礙瘢痕的形成。蔡海豐等[18]研究顯示，通過(guò)磷酸腺苷激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）激動(dòng)劑降低TGF-1β及IL-6的表達(dá)，可抑制成纖維細(xì)胞增加，阻礙人皮膚異常瘢痕的形成。VEGF可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，進(jìn)而促進(jìn)新生血管的生成；還可通過(guò)誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞的增殖進(jìn)而促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖，在青光眼濾過(guò)手術(shù)修復(fù)過(guò)程中具有修復(fù)作用。卞新海[19]對(duì)兔建立耳瘢痕實(shí)驗(yàn)顯示，點(diǎn)陣CO2激光聯(lián)合積雪苷霜軟膏通過(guò)抑制TGF-β1和VEGF的表達(dá)，可抑制瘢痕組織的增生。α-SMA是成纖維細(xì)胞的特異性標(biāo)志物之一，可通過(guò)自身的高表達(dá)進(jìn)而使成纖維細(xì)胞活化，使其合成膠原的能力提升，導(dǎo)致瘢痕形成[20]。黃學(xué)思等[21]運(yùn)用絲裂霉素C以及青光安混懸液等藥物治療青光眼術(shù)后瘢痕實(shí)驗(yàn)研究表明，通過(guò)降低膠原纖維、α-SMA及纖維黏連蛋白的水平，可抑制青光眼術(shù)后瘢痕的形成。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相似。

綜上所述，ROCK 抑制劑可通過(guò)降低TGF-β1 mRNA、ROCK mRNA、IL-1β、IL-6、VEGF、α-SMA的表達(dá)進(jìn)而抑制成纖維細(xì)胞的增殖，從而提高手術(shù)的成功率，阻礙青光眼術(shù)后瘢痕的形成。