皺皮香豬HAS2基因SNPs的鑒定及生物信息學分析

吳行雕，石道宏，黃世會，牛 熙，李 升，王嘉福，冉雪琴*

(1.貴州大學動物科學學院,貴陽 550025；2.農業生物工程研究院，貴陽 550025)

皮膚是哺乳動物最大的器官，構成機體免受物理、生物和化學損害的第一道屏障。同時皮膚還參與機體感受外界刺激、分泌、排泄、物質的吸收、調節體溫、參與新陳代謝和免疫反應等生理功能[1]。豬HAS2基因位于豬4號染色體上，基因全長4 378 bp，共有4個外顯子，編碼552個氨基酸，其功能是編碼透明質酸合成酶2。HAS2是3種 特征性的膜包埋HA合成酶，是原代細胞和完整間皮中含量最豐富的酶類。HAS2負責從細胞內前體合成高分子量的HA，具有維持組織結構和體液平衡的重要作用,在機體組織擴張和生長過程中意義重大[2]。透明質酸(HA)是大多數動物組織細胞外基質(ECM)的線性高分子糖胺聚糖，在調節細胞間黏附[3]、遷移[4]、分化[5]和增殖[6]等方面發揮重要作用。

對沙皮犬和裸鼴鼠皮膚表型的研究證明，沙皮犬的透明質酸合成酶2(hyaluronan synthase 2，HAS2)上游約253 kb處有一段16.1 kb的不穩定重復，導致HAS2基因異常高表達，產生過量的透明質酸，透明質酸沉積，出現大量的皮膚褶皺[7]。裸鼴鼠NMR成纖維細胞分泌超高分子量的透明質酸(HA)，是人或小鼠HA的5倍以上。哺乳動物的HAS2蛋白序列高度保守[8]，但裸鼴鼠HAS2基因發生了突變，使保守的天冬氨酸突變為絲氨酸，可能是裸鼴鼠HMM-HA過度積累的原因[9]。說明HAS2基因的變異與皮膚皺褶的產生關系密切。

研究表明，對皮膚發生極厚折疊患有黏蛋白沉著癥的1名兒童的研究發現，其皮膚中沉積的黏液物質主要為多糖透明質酸(HA)[10]。HAS2的過表達在人、狗、鼠、雞、豬等生物體內存在且主要與一些疾病、復雜性狀及物種進化相關[11]。如HAS2的過表達在22～24期胚胎雛雞翼芽間質細胞中阻止了在微團培養和隨后的軟骨形成過程中的凝結事件[12]。在乳腺癌細胞中，高水平的HA及其CD44受體通常與雌激素信號傳導的改變有關，HAS2的過表達增加了ERα Ser118的磷酸化以及雌激素的轉錄活性[13]。此外，HAS2的過表達促進體外乳腺癌細胞的侵襲[14]和體內乳腺腫瘤的生長[15-16]。對HMM-HA具有預防癌癥和增強皮膚彈性的研究發現，HMM-HA在裸鼴鼠中是由HAS2基因的一個獨特的修飾功能發生改變產生的[17-18]。在大鼠間皮細胞中HAS2的過表達可誘導形成長而多的微絨毛樣細胞突起，對大鼠組織和體液的正常功能和維持至關重要[19]。對老年小鼠MV中HA水平隨年齡增長而升高機制的研究表明，HAS2的mRNA和蛋白表達增加了，導致HA在腦MV中合成和積累增加，改變了神經炎癥的環境，并促進了與年齡相關的腦微血管密度和功能的改變[20]。這些研究結果提示，HAS2的過表達導致HA合成和積累的增加可能與動物疾病相關。

香豬是中國特有的小型地方豬種之一，香豬額頭有菱形或“川”字形褶皺，而軀干部一般無明顯褶皺[21]。皺皮香豬是從正常香豬中分離出來的變異群體，其皮膚表現為全身密布褶皺。皺皮香豬親本交配所產F1代仔豬中，大約三分之一個體有皺皮表現，說明皺皮性狀可以遺傳給后代[22]。皺皮香豬主要的特征是個體軀干部皮膚增厚并出現大量的條紋狀褶皺，皮膚粗糙發紅無明顯彈性且個體生長減慢。為了探究皺皮香豬個體產生皮膚褶皺的原因，本研究主要針對HAS2基因編碼區進行研究，探討香豬皮膚褶皺發生的分子遺傳機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

30頭皺皮香豬(XPZ)和100頭正常香豬(XP)耳組織樣品均采自貴州大山地生態養殖有限責任公司的豬場。以上香豬耳組織均采用上海生工生物工程(上海)股份有限公司生產的血液/組織基因組提取試劑盒，參照基因組提取試劑盒說明書提取樣品基因組DNA，質檢合格后保存于-20 ℃備用。

1.2 主要試劑與儀器

血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒、2×Taq PCR Master Mix均購自北京天根生化科技有限公司；Thermo Cycler PCR儀、電泳儀和凝膠成像系統均購自Bio-Rad公司；高速臺式離心機購自美國貝克曼庫爾特公司。

1.3 基因片段擴增和SNP位點分析

在NCBI上下載HAS2基因序列(GenBank登錄號：NC_010446.4)，采用Primer Premier 5.0設計引物序列，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。以基因組DNA為模板進行PCR檢測，使用20 μL反應體系：基因組DNA 1 μL，10 pmol·L-1的上、下游引物各0.5 μL，2×Taq PCR Master Mix 10 μL，ddH2O 8 μL。PCR擴增條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性30 s，(51～61)℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共34個循環；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收后，擴增片段由擎科生物科技有限公司進行核苷酸序列測定。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.4 HAS2基因mRNA二級結構和蛋白質高級結構預測

利用在線軟件RNAfold(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgibin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi)對HAS2基因突變前后編碼區序列mRNA二級結構進行分析；利用在線軟件SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預測和分析HAS2基因編碼區突變前后蛋白質的二級結構；利用在線軟件SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)預測HAS2基因編碼區突變前后蛋白質的三級結構。

1.5 HAS2基因密碼子偏好性的分析

利用CondoW軟件和Codon Usage Database數據庫(htt://www.kazusa.or.ip/codon/)對HAS2基因編碼區序列密碼子進行分析。

1.6 遺傳多態性分析

應用Megalign和Seqman軟件對香豬HAS2基因原序列與測序峰圖進行序列比對分析，確定SNPs位點。應用Excel軟件分別計算不同位點在受試群體中的基因型頻率、等位基因頻率、有效等位基因數(Ne)、群體遺傳純合度(Ho)和多態信息含量(PIC),運用在線軟件SHEsis(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)和Paploview(Version 4.2)軟件計算SNPs的連鎖不平衡參數，分析多態位點是否偏離哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium,HWE)狀態，并構建單倍型。

1.7 基因變異的群體遺傳學分析

采用SPSSv20.0卡方檢驗分析4個SNPs位點在群體間的分布差異。等位基因頻率計算公式為P=X/M。式中,P表示SNP位點基因型頻率，X、M分別表示基因型數和樣本總數。

2 結 果

2.1 基因編碼區擴增

以香豬HAS2基因DNA為模板對第1～4外顯子進行PCR擴增，擴增產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)，應用HAS2-1引物對擴增796 bp的外顯子1區域，HAS2-2引物對擴增751 bp的外顯子2區域，HAS2-3引物對擴增288 bp的外顯子3區域，HAS2-4引物對擴增1 921 bp的外顯子4區域。

PCR檢測片段的大小與預期目的片段大小一致，特異性良好，達到測序標準。目的片段經膠回收后測序，測序結果與GenBank數據庫中HAS2基因(NCBI accession No.:AEMK02000022)4個外顯子收錄的序列一致。

2.2 堿基序列和變異位點分析

將普通香豬和皺皮香豬PCR擴增產物膠回收克隆后進行測序，應用DNAStar軟件中Seqman程序將測序結果與NCBI中公布的豬HAS2基因(NCBI accession No.:AEMK02000022)進行序列比對，在豬HAS2基因外顯子區挖掘得到4個SNPs位點。結合測序峰圖(圖2)，4個SNPs位點參照豬HAS2基因mRNA完整序列(RefSeq:NM_214053.1)分別命名為T221A、A228G、T183C和C537T。T221A位于第1外顯子中，定位于CDS區第211位堿基，堿基T突變為A，可導致亮氨酸替換為賴氨酸。A228G 位于第1外顯子中，定位于CDS區第228位堿基，堿基A突變為G為同義突變。T183C和C537T位點分別定位于第2外顯子CDS區第183位和第4外顯子CDS區第537位堿基，堿基T突變為C、C突變為T，都為同義突變位點。

A.第一外顯子；B.第二外顯子；C.第三外顯子；D.第四外顯子。M.DNA相對分子質量標準；1.普通香豬；2～3.皺皮香豬A.Exon 1;B.Exon 2;C.Exon 3;D.Exon 4.M.DL2000 marker;1.XP;2-3.XPZ圖1 香豬HAS2基因外顯子區PCR擴增產物瓊脂糖電泳檢測Fig.1 Detection of exon regions in HAS2 gene of Xiang pip using PCR method by agarose gel electrophoresis

圖2 HAS2基因SNPs鑒定Fig.2 SNPs identification of HAS2 gene

2.3 HAS2基因SNP位點對mRNA二級結構的影響

HAS2基因外顯子1上的T221A和A228G 2個 突變位點組合對mRNA序列二級結構影響的預測結果見圖3。T221A和A228G 位點在mRNA二級結構中都位于環上，TA組合mRNA序列結構的自由能為-573.29 kJ·mol-1，TG組合的自由能為-580.89 kJ·mol-1，AA組合的自由能為-571.03 kJ·mol-1，AG組合的自由能為-572.66 kJ·mol-1，穩定性為：AA>AG>TA>TG，TG與參考基因組收錄的序列相同，突變堿基使mRNA的自由能和穩定性降低。

圖3 HAS2基因T221A和A288G位點對mRNA二級結構的影響Fig.3 The effects of T221A and A288G loci of HAS2 gene on the secondary structure of mRNA

2.4 HAS2基因變異對蛋白質結構的影響

對T221A位點突變導致氨基酸序列出現亮氨酸替換為賴氨酸后蛋白質一級結構(表2)、二級結構(表3)和三級結構(圖4)的變化進行預測，亮氨酸替換為賴氨酸后，蛋白質一級結構的等電點由9.37變為9.49，不穩定系數由51.97變為50.69，脂肪系數由75.19變為73.06，總平均親水性由-0.345變為-0.387。蛋白質二級結構中的α螺旋由35.52%變為32.97%，自由卷曲由43.17%變為44.51%，β轉角由6.56%變為6.59%，延伸鏈由14.75%變為15.93%，三級結構預測結果(圖4)與二級結構發生變化相一致。

表2 T221A錯義突變對HAS2蛋白質一級結構的影響Table 2 Effect of T221A missense mutation on the primary structure of HAS2 protein

表3 T221A錯義突變對HAS2蛋白質二級結構的影響Table 3 Effect of T221A missense mutation on the secondary structure of HAS2 protein %

圖4 T221A位點錯義突變對HAS2蛋白質三級結構的影響Fig.4 Effect of T221A missense mutation on the tertiary structure of HAS2 protein

2.5 密碼子偏好性分析

A228G、T183C和C537T位點分別位于HAS2基因外顯子1、2和4中產生同義密碼子突變：CAA→CAG、CTT→CTC和TCC→TCG。使用CondonW軟件對香豬HAS2基因的密碼子特性進行分析。RSUC值即單個密碼子使用頻率占總體的百分比，當某一密碼子的RSCU大于1時，代表該密碼子為使用相對較多的密碼子,反之亦然。通過密碼子(codon usage database)數據庫查找豬的2 953個CDS區的1 168 059個密碼子，A228G位點谷氨酰胺同義密碼子中CAA(RSCU=1.45)相對CAG(RSCU=0.5)偏好性較強，T183C位點亮氨酸同義密碼子CTT(RSCU=0.65)和C537T位點絲氨酸同義密碼子TCC(RSCU=0.42)無偏好性。

2.6 SNPs位點的基因型頻率及遺傳多態性分析

對各SNP位點進行AS-PCR方法檢測，擴增產物經2%的瓊脂糖凝聚電泳分離(圖5)。4個SNPs位點經測序所得的基因型與AS-PCR所得基因型完全一致。依據AS-PCR引物設計策略將F1/R2擴增出的片段定義為T基因，F2/R2擴增出片段定義為A基因。T221A位點基因型在香豬中以TA型為主，計算等位基因頻率(表4)，皺皮香豬群的A等位基因頻率顯著高于普通香豬群(P<0.05)。A228G位點基因型在香豬中以AA和AG型為主，皺皮香豬群的G等位基因頻率極顯著高于普通香豬群(P<0.01)。T183C和C537T兩個位點在香豬中均以TC/CT型為主，C/T等位基因頻率差異不顯著(P>0.05)。

表4 兩個豬群SNPs位點的基因型頻率和等位基因頻率Table 4 Genotype frequency and allele frequency of SNP loci in two pig populations

對T221A、A228G、T183C和C537T位點的多態性進行分析(表5)，試驗群體中4個SNPs位點的純合度均較高，香豬和皺皮香豬中 T221A、T183C和C537T位點的多態信息含量分別為0.363 7和0.375 0、0.374 9和0.373 9、0.373 4和0.375 0，均表現為中度多態(0.250.05)，可用于下一步的連鎖不平衡分析。

表5 HAS2基因4個SNPs位點的多態性參數分析Table 5 The genetic parameters at 4 SNPs loci of HAS2 gene

2.7 連鎖不平衡分析與單倍型構建

采用SHEsis在線軟件對HAS2基因T221A和A228G位點進行連鎖不平衡參數估計及單倍型構建。結果顯示，2個SNPs位點間僅在皺皮香豬群體中處于連鎖不平衡狀態(r2=0.253，表6)，2個位點間可構建4種單倍型：A-A、A-G、T-A和T-G(表7)，皺皮香豬中以T-A和T-G單倍型為主，頻率分別為27.5%和27.5%，T-A單倍型頻率在2個群體間的差異極顯著。

表6 HAS2基因2個SNPs位點間的連鎖不平衡分析Table 6 Linkage disequilibrium parameters estimation between 2 SNPs loci of HAS2 gene

表7 HAS2基因2個SNPs位點間的單倍型構建Table 7 Haplotype establishment in 2 SNPs loci of HAS2 gene

3 討 論

研究豬皮膚性狀、生長發育和皮膚病理變化等生命規律可為人類醫學相關研究提供重要的借鑒。豬和人的DNA相似度高達83%，豬皮膚在形態結構上跟人類皮膚相近，可作為人類皮膚代替物[23]。如用豬皮作為人類燒傷皮膚的異種植皮來源，豬皮可作為人類皮膚替代物進行藥物試驗或模擬治療[24]。為了更好地了解豬皮膚的性狀表型和生長發育規律，本研究以深入了解皺皮香豬皮膚褶皺的變化規律和探究其分子遺傳控制機理為出發點，開展相關豬皮膚褶皺的研究工作。通過特異性PCR 方法克隆HAS2基因的外顯子編碼區，應用生物信息學方法分析測定基因編碼區的堿基變異，在普通香豬和皺皮香豬資源群體中共篩選到HAS2基因的4個SNPs位點，分別為T221A、A228G、T183C和C537T，其中T221A屬于錯義突變，可導致亮氨酸(脂肪族類氨基酸)替換為賴氨酸(帶正電荷的堿性氨基酸)。本研究利用AS-PCR對4個SNPs位點進行群體驗證，在T221A和A228G兩個位點檢測到有多態性，在T183C和C537T位點沒有檢測到多態性。皺皮香豬中HAS2基因外顯子1的兩個堿基發生變異，即T221A和A228G,在皺皮香豬中的發生頻率明顯高于普通香豬。其中，T221A位點基因型在香豬群體中以TA型為主(P<0.05),皺皮香豬A等位基因的頻率明顯高于普通香豬；A228G位點基因型在香豬群體中以AA型為主(P<0.01),皺皮香豬G等位基因的頻率顯著高于普通香豬；T183C和C537T位點基因型在香豬群體中均以雜合TC基因型為主，皺皮香豬C和T等位基因頻率與普通香豬沒有明顯差異(P>0.05)。單個SNP基因座一般只有二態，采用多個SNPs位點進行單倍型分析，可提高分子標記與QTL的連鎖程度，比單個SNP位點的研究更有價值[25]。在本研究中，T221A和A228G位點在皺皮香豬群體中緊密連鎖(r2=0.253)。

M.DNA相對分子質量標準；1～6.AS-PCR引物擴增產物M.DL2000 DNA marker；1-6.The amplified products by AS-PCR primer圖5 AS-PCR擴增Fig.5 AS-PCR amplification

最近研究表明，基因mRNA一級結構和二級結構穩定性的變化在翻譯過程中具有調節作用[26]，研究發現該調節過程形式較為復雜，但最終表現為對蛋白質表達量顯著正相關調控，且這種正相關不受mRNA結構、豐度等其它因素的影響[27]。本研究中，T221A和A228G位點突變后的堿基可降低皺皮香豬HAS2基因mRNA的自由能值和二級結構的穩定性，同時發生的氨基酸替換增加了蛋白的電荷量，可能引起蛋白二級結構和三級結構發生變化，影響酶的活性，進而影響HA的合成，可能與皺皮香豬全身性皮膚的不均勻增厚并發生褶皺有關。通過查找同源基因比對和NCBI中的SNP數據庫發現，T221A、A228G和C537T變異位點在豬和其它物種HAS2基因中沒有被報道過，推測3個SNPs位點是新發現的豬變異位點。在檢測到的4個SNPs位點中，T183C位點是已知的。T183C位點位于豬chr4:17596662上，編號為rs319553912。該變異位點在其它豬種和物種HAS2基因中有被標記，如在歐洲豬、二花臉豬、浦東白豬以及人、貓、鼠、狗、牛等中均被檢測到。推測T183C位點在豬和其它物種中普遍存在且突變沒有引起氨基酸改變，可能對遺傳性狀表型的影響較小[28-29]。群體檢測結果表明，T221A和A228G位點在普通香豬與皺皮香豬群體中具有變異程度大、多態含量豐富的特點，便于群體中有利基因型的定向選擇。其在今后可作為皺皮香豬的分子標記，以剔除群體中的皺皮基因。

用微衛星標記進行了豬皮膚褶皺和厚度性狀的連鎖分析，發現在二花臉豬的F2代資源群體4號染色體上的107 cM處有1個主效QTL位點與皮膚褶皺性狀相關[30]。沙皮犬全基因組單核苷酸多態性分析表明，在13號染色體HAS2基因的上游約253和350 kb處有一段16.1 kb的不穩定重復序列，該獨特區域包含一個或多個改變HAS2表達的調控元件[31]。似乎隨著復制拷貝數的增加，復制中潛在增強子元件的拷貝數也會增加，可能導致HAS2基因異常高表達，產生過量的HA，導致透明質酸沉積，出現大量的皮膚褶皺[32]。在裸鼴鼠HAS2基因外顯子2和4上發現2個SNPs，導致細胞質結構域高度保守的兩個天冬氨酸被絲氨酸替換致使HAS2分子產生HMM-HA，導致HA在皮膚中過度積累而引起皮膚表型的改變[33]。這些研究結果提示，在皺皮香豬HAS2基因外顯子2上發現的2個堿基變異可能與皺皮香豬全身性皮膚不均勻增厚并發生褶皺有關。

研究發現，影響皮膚褶皺形成的原因很多，在雌性個體中，HAS2基因的表達調控雌激素的水平，而雌激素水平影響著皮膚皺褶的形成[34]。人HAS2基因編碼一種制造透明質酸的酶，透明質酸濃度的變化與許多病理情況有關，包括皺紋、創傷、幾種炎癥性疾病和惡性腫瘤[35]。皮膚細胞外基質的改變也可能與皮膚褶皺有關，外源性透明質酸片段通過與受體蛋白如CD44和RHAMM結合來影響細胞行為[36]。在炎癥和特定組織重構過程中，TSG-6蛋白可催化IαI重鏈結構域共價轉移至HA導致細胞周圍環境的物理化學控制發生變化[37-38]，HA片段在與蛋白質的結合相互作用中競爭，改變生物基質的完整性。HA片段可以取代與細胞表面受體相互作用的大分子物質，導致受體聚集和信號改變[39]，片段也可以通過交替的受體[40-41]發出信號。因此，HA可被視為細胞微環境破壞過程中的生物傳感器，改變高刺激和低刺激組的細胞反應機制。在組織重塑過程中，包括皮膚褶皺的形成、傷口愈合和腫瘤發生都與HA含量和大小的變化有關[42-44]。這些研究表明，引起HAS2基因過表達導致HA在皮膚細胞外基質或組織中積累的影響因子與皮膚病或其它疾病的發生發展有著密切的關系，提示皺皮香豬HAS2基因發生單堿基變異可能通過密碼子的偏好和mRNA的穩定性影響基因的表達量從而影響酶的活性，進而影響HA的合成，可能與皺皮香豬全身性皮膚不均勻增厚并發生褶皺有關。

4 結 論

本研究結果提示，在皺皮香豬中發現了3個新的SNPs位點，分別是位于外顯子1上的T221A錯義突變(導致亮氨酸替換為賴氨酸)、A228G及外顯子4上的C537T同義突變，2個外顯子突變可引起mRNA自由能和蛋白結構的變化。T221A和A228G位點在香豬群中呈多態性變化且等位基因頻率在皺皮香豬與普通香豬群體中存在明顯差異，皺皮香豬A和G等位基因頻率顯著高于普通香豬，T221A和A228G位點構成的單倍型T-A在皺皮香豬群體中緊密連鎖。HAS2基因的T221A和A228G位點變異可能導致透明質酸合成酶2過表達產生過量的透明質酸，引起豬皮膚產生褶皺。兩個位點可作為影響皺皮香豬皮膚褶皺性狀的分子標記。