水牛附睪不同部位精子超微結構及熒光標記差異分析

何翁潭，張鵬飛，黃愉淋，肖 凱，黃良鳳，陸陽清*，張 明*

(1.廣西大學動物繁殖研究所 亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室，南寧 530004;2.廣西中醫藥大學基礎醫學院 細胞與遺傳學教研室，南寧 530004)

精子到達附睪時，雖有完整的形態學特征，但缺乏運動能力，不具備受精能力，仍然屬于不成熟的生殖細胞。精子在經過附睪成熟后才獲得運動及受精的能力[1]，這一過程稱為精子的成熟[2-4]。附睪附著在睪丸上，是一條連接睪丸和輸精管的細長導管，里面包含有數條細的小管并布滿纖毛，纖毛的擺動引起液體流動使精子懸浮在管腔內，從附睪頭部向尾部轉運[5-6]。附睪具有分泌激素、離子、蛋白質等物質的功能，多數物質是以微囊泡的形式轉運分泌[7-8]。附睪小管是高度有序的分段器官，每個分段部位的上皮細胞內具有獨特的基因表達譜，這些基因轉錄翻譯成蛋白質并特異性分泌，直接或間接影響精子在附睪中成熟，并且上皮細胞可以調節基因片段特異性表達，進而形成特殊的精子成熟微環境[9-11]。附睪在結構上被分成頭部、體部和尾部3部分或者更多部位[12-13]，精子在附睪轉運過程中逐漸成熟，并儲存在遠端的尾部區域，直到射精[13]。在睪丸中完成精子發生的精子首先進入附睪頭部，附睪頭部會大量吸收睪丸液，精子在附睪轉運過程中，附睪對其進行了重塑，包括頂體和核的變化以及細胞質液滴脫落等[14]，進而精子的形態結構、能量代謝和生理功能發生變化，逐漸獲得了運動能力，發育成為具有活力的成熟精子，具備精卵識別能力和受精能力[15-16]。

精子自身結構是否具有一定的完整性與受精能力密切相關。熒光分子探針可探究細胞的某些結構功能狀態，是測量活細胞內部生理變化的一種手段[17]。因此，使用熒光分子探針標記可準確、清晰評估精子細胞特定結構的完整性和功能。碘化丙錠(PI)是可進入受損質膜的細胞中與DNA結合，而無法穿過完整細胞膜的一種熒光探針，可用于檢測質膜完整性，另外還有可以穿過細胞膜與核酸結合的熒光探針赫斯德染料：Hoechst 33258(H258)、Hoechst 33342(H342)[18-19]。花生凝集素(FITC-PNA)可以特異性結合精子頂體，檢測精子的頂體狀態[20]，也可用于測定質膜完整性，在牛、馬、犬、貓精子染色上都得到有效應用[21-22]。線粒體分子探針(Mito-Tracker)可以與線粒體特異性結合，對線粒體的染色依賴于線粒體膜電位，進而檢測線粒體功能的完整性[23]，高線粒體膜電位是精子具有受精能力的特征之一[24-25]。流式細胞儀分析不同熒光探針的標記情況可以評估不同的精子狀態，并能夠在幾秒內分析數以千計的細胞[6]，具有高的統計穩健性。

本研究運用透射電鏡觀察以及熒光標記染色的方法，觀察和分析附睪頭、體和尾部位的精子，尋找這3部位精子在外部形態和結構上的異同，從而揭示精子在附睪成熟過程中的具體變化，為研究水牛精子在附睪中的成熟機理提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從南寧市屠宰場獲得性成熟期(2～3歲)水牛新鮮的附睪材料，水牛類型為廣西本地沼澤型水牛。

1.2 主要試劑

精子稀釋液、Percoll細胞分離液、Anhydrous Dimethyl Sulfoxide均購自北京索萊寶公司；環氧樹脂812購自美國SPI公司；檸檬酸鉛，醋酸雙氧鈾、200目碳膜支持銅網購自中鏡科儀公司；Hoechst33342、PropidiumI odide(PI)購自碧云天公司，Fluorescein-labeledlectinfrom Arachishypogaea(FITC-PNA)購自Sigma-Aldrich公司；Mito-TrackerTMRed CMXRos 購自Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 附睪HE染色 取新鮮附睪的頭部、體部和尾部，在4% 聚甲醛中固定，經脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、粘片和烤片及脫蠟后將切片用蘇木素染色，鹽酸分化，氨水反藍，水洗后依次投入梯度酒精中脫水，再入伊紅染色，無水乙醇、二甲苯中透明，然后用中性樹膠封片，鏡檢和采集圖像。

1.3.2 附睪精子分離純化 取出新鮮的水牛睪丸組織，分離附睪，將附睪按照形態學特征分離為頭、體和尾3部分。26 ℃條件下將附睪樣品在精子稀釋液中去除表面白色結締組織后剪碎，通過40 μm 孔徑篩子過濾；室溫條件下300×g，3 min,棄上清，重懸后用 Percoll密度梯度離心。Percoll分離方法參照文獻描述并做適當改進[26]。在試管中加入預先配置好的Percoll工作液，從下到上濃度依次90%、43%、30%。在分離液上層加入適量的精子懸液后進行離心，離心力與時間設定分別為 50×g，1 min；100×g，1 min；150×g，30 s；200×g，30 s；250×g，30 s；300×g，15 min。離心結束后，可觀察到管中溶液分為3層，吸取最下層精子(90%與43%之間)，漂洗后備用。

1.3.3 精子運動能力評估 收集到的精子重懸于精子稀釋液中立刻進行精子運動能力評估(CASA)分析。將精子各取20 μL分別注入預熱的20 μL CASA腔室(精子分析儀(CASA)IVOS IITM，Hamilton Thorne，美國)中，置于倒置熒光顯微鏡(Olympus，日本)顯微鏡的恒溫加熱臺上(35 ℃)。用Hamilton Thorn CEROS CASA系統(版本14.0)評估運動學參數。以60 Hz的頻率采集30個視頻幀，每個單元設置13個跟蹤點[27]。本部分共設置4組生物學重復。

1.3.4 透射電鏡觀察 將分離出的精子加入2.5%的戊二醛固定過夜，300×g離心，PBS漂洗3次,加入1%鋨酸,固定20 min，PBS漂洗離心3次。將4 g瓊脂和100 mL超純水充分混合煮沸至充分溶解，冷卻至37 ℃，滴加入精子，制備含有精子的瓊脂塊。將包埋塊修成1 mm3大小，進行30%、50%、70%、80%、90%酒精梯度脫水各5 min，100%丙酮脫水3次，每次5 min。將脫水后的瓊脂塊和Spurr樹脂包埋劑按比例浸潤，分別為常溫1 h(75%丙酮，25% Spurr樹脂包埋劑)，常溫1.5 h(25%丙酮，75% Spurr樹脂包埋劑)，100% Spurr樹脂包埋劑37 ℃放置12 h、45 ℃放置12 h、60 ℃放置24 h。取出聚合好的樹脂樣品進行超薄切片,厚度50 nm，用撈片環撈取薄片放置200目銅網上。室溫避光進行負染首先0.5%醋酸鈾15～30 min，水洗后3%檸檬酸鉛3～7 min，水洗，烘烤后上鏡，通過TEM(日本日立)電鏡觀察，拍照。

1.3.5 精子頂體染色 精子頂體染色方法參照前人描述并做適當改進[20,27-30]，結合本次研究具體觀察對精子進行分類。將分離的精子分別用4%多聚甲醛固定30 min，用PBS漂洗3次(300×g，3 min)后用1%Triton X-100(Sigma-Aldrich Co)處理5 min，然后用PBS漂洗3次后進行FITC-PNA(6 μg·mL-1)與PI(0.8 mg·mL-1)混合染色15 min，漂洗后用Hoechst 33342(1 μg·mL-1)染色10 min，然后用PBS對精子漂洗2次去除多余染料，再滴加熒光抗淬滅劑，最后注入20 μL腔室的載玻片，進行熒光顯微鏡觀察并拍照，使用ImageJ軟件(版本1.47 v)對拍照結果分析。

1.3.6 流式細胞儀分析 將精子樣品用PBS重懸至濃度為1×105個·mL-1。每個樣品取500 μL，分別加入試管，定容體積至1 mL，染料及濃度為PI(0.8 mg·mL-1)、FITC-PNA(6 μg·mL-1)、20 nm Mito-TrackerRed，避光22 ℃孵育30 min。孵育后進行PBS漂洗，用2%的多聚甲醛中固定，固定后的精子用4 ℃的 PBS重懸后用流式細胞儀分析。流式細胞儀為AttuneTMAcoustic Focusing Cytometer(Thermo Fisher)。YL2(585/40帶通濾光片)評估碘化丙啶熒光，使用YL2(585/40帶通濾光片)測量Mito-Tracker紅色熒光，BL1(488/40帶通光片)評估綠色熒光。計數：5萬個，流速：100 μL·min-1。使用FlowJo(FlowJo V 10軟件；俄勒岡州阿什蘭)軟件分析。

1.3.7 數據統計與分析 數據應用SAS系統中GLM模塊進行多重比較。當P<0.05時，被認為差異是顯著的。結果顯示為：百分比(%)，“平均值(mean)±平均標準誤(SEM)”。研究設置3次生物學重復，3次技術重復。

2 結 果

2.1 附睪HE染色

為觀察附睪不同部位組織的形態差異，分別對附睪頭、體和尾3部分進行HE染色。附睪小管直徑尾部最大；附睪小管上皮基膜外側是薄層平滑肌(圖1中a箭頭)，并從附睪頭至尾部逐漸增厚；附睪上皮中的細胞核深染，位于細胞近腔面有游離的纖毛伸入管腔(圖1中b箭頭)，頭部附睪小管絨毛相對較長。

A.附睪頭部；B.附睪體部；C.附睪尾部。a箭頭所示為平滑肌層，b箭頭所示為微絨毛，深染為細胞核，淺染為細胞質。微絨毛游離于管腔A.The caput of epididymis;B.The corpus of epididymis;C.The cauda of epididymis.The black arrow points to the smooth muscle layer,the red arrow points to the microvilli,the deep stain is the nucleus,and the light stain is the cytoplasm.The microvilli are close to the lumen圖1 附睪頭、體和尾3部分HE染色Fig.1 HE staining of caput,corpus and cauda of epididymis

2.2 精子純化和活力分析

Percoll分離后，結合Hoechst 33342染色觀察統計，精子存在于90%～43%濃度層，純度達到95%，圖2展示純化后的精子。通過計算機輔助精子分析系統(CASA)發現(表1)，附睪頭、體和尾部精子活力分別是：8.35%、20.21%和65.6%(P<0.05)；而原生質滴脫落情況為頭部與體部和尾部有差異顯著(P<0.05)，體部和尾部差異不顯著(P>0.05)。

表1 用CASA分析所得精子特性Table 1 The CASA analysis of spermatozoa in the caput,corpus and cauda of epididymis %

A.附睪頭部精子；B.附睪體部精子；C.附睪尾部精子A.The spermatozoa from the caput of epididymis;B.The spermatozoa from the corpus of epididymis;C.The spermatozoa from the cauda of epididymis圖2 Percoll梯度離心后附睪頭、體和尾3部分精子Fig.2 The spermatozoa of the caput,corpus and cauda of the epididymis after Percoll gradient centrifugation

2.3 精子形態差異分析

采用透射電鏡觀察附睪3部位精子超微結構。首先對正常精子進行觀察，精子頭部呈典型圓錐狀，核(N)被染色后顏色較深電子密度均勻，核膜(PM)被覆在核外周，頂體(AC)覆蓋在頭部上部分外部(圖3A)；尾部軸絲(AX)包括9對外部雙微管和 1個中心對的“9×2+2”結構,外周致密纖維(ODF)整齊排列,線粒體鞘(MS)規則得排列在中段，頸部(NA)不同的切面呈現的形狀(圖3B)；精子尾部中(線粒體鞘包裹軸絲)、主(纖維鞘包裹軸絲)、末段(胞膜包裹軸絲)縱切面可觀察到軸絲、外周致密纖維、纖維鞘、以及線粒體鞘結構,橫切面尾部從中段到末段的變化依次為線粒體鞘(MS)消失，軸絲(AX)、纖維鞘(FS)延伸到尾末端，最后在末端消失(圖3C)。通過觀察發現附睪頭部、體部以及尾部的精子都存在著完整的頂體、頸部、尾部等結構。

A.精子頭部縱切面，AC.頂體；PM.核膜；N.核染色質。B.精子尾部中、主、末段各個不同橫截面，AX.軸絲；MS.線粒體鞘(線粒體螺旋)；ODF.外周致密纖維。C.精子尾部縱切面，FS.纖維鞘；NA.頸部A.Vertical section of spermic head region,AC.Acrosome;PM.Nuclear membrane；N.Nuclear chromatin.B.Different cross-sections of the middle,main and terminal segments of the spermic tail region,AX.Axon；MS.Mitochondrial sheath (mitochondrial helix)；ODF.Outer dense fibers.C.Vertical section of the spermic tail region,FS.Fibrous sheath；NA.Neck圖3 水牛附睪中精子超微結構Fig.3 Ultrastructure of spermatozoa in the buffalo epididymis

通過對畸形精子部位及種類觀察發現頭部異常的類型主要包括破損、膨脹、質膜分離，頂體囊泡化(圖4)；頸部畸形包括斷裂和線粒體鞘的結構異常(圖5)；尾部異常主要發生在精子線粒體鞘(MS)和纖維鞘(FS)膨脹和缺失、破損，外周致密纖維(ODF)和軸絲(AX)紊亂、缺失(圖6)。

a、b.頂體缺失；c.頂體外膜膨脹；d.質膜分離；e.頂體囊泡化輕度膨脹外膜部分形成二串大小不等的空泡a,b.The absence of acrosome;c.The expansion of acrosomal extracorporeal membrane;d.The separation of plasma membrane;e.The acrosome vesicles and slightly swelling,forming two vesicles of different sizes in the outer membrane圖4 精子頭部異常Fig.4 The abnormalities of spermic head region

A.線粒體鞘排列缺失、紊亂，箭頭a所指；B.中心粒缺失，箭頭b所指A.The absence of mitochondrial sheath,Mitochondrial sheath loss,pointed by arrow a;B.The absence of centriole,pointed by arrow b圖5 精子頸部畸形Fig.5 The abnormalities of the spermic neck region

A.線粒體鞘膜脫落；B.線粒體鞘膜缺失；C.原生質滴未脫落；D.線粒體鞘膜膨脹；E.軸絲紊亂、分散、缺失(箭頭a)；線粒體鞘膜破損(箭頭b)；F.軸絲缺失；G.鞘膜破損，軸絲裸露和丟失；H.雙尾畸形A.Mitochondrial sheath shedding;B.Mitochondrial sheath loss;C.Protoplast drop not shedding;D.Mitochondrial sheath swelling;E.Axonal filament disorder,Axonal filament dispersion,Axonal filament loss(arrow a);Mitochondrial sheath membrane damage(arrow b);F.Axons loss;G.Damaged sheath,exposed and axons loss;H.Double-tailed deformity圖6 精子尾部畸形Fig.6 The abnormalities of the spermic tail region

2.4 流式細胞儀分析

對附睪頭、體和尾部分精子進行流式分析(圖7)，并對數據進行統計分析發現精子質膜完整率在附睪頭部最低，從頭部到尾部，精子質膜完整率增大，高線粒體膜電位精子比率逐漸增大(P<0.05)，頂體高熒光強度比率增大，但差異不顯著(表2)。

表2 附睪頭、體和尾部精子流式分析Table 2 Flow cytometry analysis of spermatozoa in the caput,corpus and cauda of epididymis %

PI染色精子，峰圖描繪了兩個亞群，左側峰表示未染色質膜完整的精子，右側峰表示質膜不完整的精子；Mito-TrackerRed染色精子，右側峰表示具有高線粒體膜電位的精子，左側峰表示線粒體膜電位低的精子；FITC-PNA是單個的峰圖，結合染色后顯微鏡下觀察，并且根據BL1通道下樣品自發熒光，計算熒光補償值后，區分FITC-PNA熒光強度大小界限，劃定有效染色精子熒光強度的大小范圍PI stained sperm,the peak diagram depicts two areas,the left area indicates that the sperm is not stained,the sperm plasma membrane is intact,the right area indicates the sperm with incomplete plasma membrane;the Mito-TrackerRed stained sperm,the right area indicates that it has sperm with high mitochondrial membrane potential,the left area represents sperm with low mitochondrial membrane potential;FITC-PNA is a single area,combined with sperm staining and observation under a fluorescence microscope,and according to the fluorescence value of the control group under the BL1 channel,the fluorescence compensation value is calculated，used to distinguish the limits of FITC-PNA fluorescence intensity and delimit the range of fluorescence intensity of effectively stained sperm圖7 流式分析圖展示附睪頭、體和尾部精子分布特征Fig.7 Flow cytometry chart showing the sperm distribution characteristics in the caput,corpus and cauda of epididymis

2.5 精子頂體染色分析

為了檢測附睪不同部位精子頂體完整性，對附睪精子進行了頂體染色分析(圖8)。發現3部位精子頂體完整比率從頭到尾依次增加，差異顯著(P<0.05)。對不完整的頂體參照前人[27,31]描述的分類方法并做適當改進，分為一類，二類，三類(表3)。

A.正常精子完整的頂體，頂體呈帽狀覆蓋在精子頭部，熒光均勻。B1～B4.類別一，無完整的頂體質膜結構的非完整頂體精子：B1.輪廓邊緣有綠色熒光；B2～B3.嚴重紊亂的頂體，頂體整部分熒光少；B4.無頂體，頭部無熒光。C1～C3.類別二，有頂體質膜結構的非完整頂體精子：C1.頂體輕度紊亂，熒光分布不均；C2.頂體紊亂；C3.重度紊亂的頂體，綠色熒光亮度異常增強。D1～ D2.類別三，有較完整頂體膜的非完整頂體精子：熒光分布紊亂、不均勻A.Intact acrosome of normal sperm,the acrosome is cap-shaped covering the sperm head,and the fluorescence is uniform.B1-B4.The first type,incomplete acrosome sperm with incomplete acrosome plasma membrane structure:B1.Green fluorescence at the edge of the contour;B2-B3.Severely disordered acrosome,the whole part of the acrosome has little fluorescence;B4.No acrosome and no fluorescence on the head.C1-C3.The second type,incomplete acrosome sperm has acrosomal plasma membrane structure:C1.Mild acrosome disorder,uneven fluorescence distribution;C2.Acrosome disorder;C3.Severely disordered acrosomes have abnormally enhanced green fluorescence.D1-D2.The third type,incomplete acrosome sperm with relatively complete acrosome membrane,but the fluorescence distribution is disordered and uneven圖8 正常精子頂體和3種類型非完整頂體類型染色效果圖Fig.8 Staining effect of normal sperm acrosomal and 3 categories of non-intact acrosome

表3 水牛附睪精子中的頂體染色Table 3 Comparison of acrosomal staining in buffalo epididymal sperm %

第一類中，頭部、體部所占總體最高，尾部所占比率較小，頭部、體部相對尾部精子差異顯著(P<0.05)。第二類中，頭部和體部占比大，尾部比率最小，頭部、體部相對尾部差異顯著(P<0.05)。第三類中，頭部比率最高，體部、尾部最小，頭部相對體部、尾部差異顯著(P<0.05)，體部與尾部無顯著差異(P>0.05)。

3 討 論

精子在附睪的成熟過程一直是精子成熟領域的研究熱點，本研究按照附睪的結構和功能分為頭、體和尾3部分[13]，對提取到的精子進行超微結構觀察、熒光分子探針特異性標記分析，探究附睪三部位精子形態學特征以及之間的差異。

在附睪HE染色試驗中，觀察到附睪小管管腔在頭部比較細小、在尾部較寬大；纖毛長度從附睪頭部到尾部逐漸變短。這些現象顯示水牛附睪結構與大象、駱駝、小鼠[13]、牦牛[32]等動物之間具有相似性。已知附睪對精子成熟過程具有重要的影響，但具體附睪每一部位中精子的變化仍需進一步研究。精子在形成的過程中由于核致密化和原生質滴脫落具有密度持續增大的特征[33]，本研究采用Percoll梯度離心法分離得到附睪頭、體和尾3部位的精子。通過CASA系統檢測分離得到水牛附睪3部位精子的活力，結果顯示，從頭部到尾部精子活力逐漸增強，與相關文獻結果一致[34]，說明了Percoll梯度離心可適用于附睪精子的分離。

精子的外部形態和結構異常影響精液質量，是雄性動物不育的重要原因。精子異常又稱為精子畸形，當精子畸形率過高，會影響精子的受精能力，并且容易造成流產[29]。有研究表明，精子尾巴的形成是一個獨特的過程，軸絲附著的動力蛋白和纖維鞘(FS)、線粒體鞘(MS)在精子尾部動力提供能量方面起著重要作用[35]，外周致密纖維(ODF)起到支撐作用[36-38]。線粒體鞘(MS)在精子變形后期形成并附著在精子尾前部分，其功能和細胞中的功能大體相似，與ODF鏈接傳導是保證精子正常能量傳遞的前提，一些相關蛋白起到聯系及穩定MS和ODF的作用[39-41]，并且發現線粒體鞘對冷打擊和冷凍保存引起的溫度變化特別敏感[42]。本研究通過透射電鏡，分別對精子頭部、頸部、體部、尾部精子超微結構進行觀察總結，發現附睪3部位精子均存在正常完整形態的精子和不同畸形狀態的精子，說明精子結構異常可能以復合型形式出現，與附睪部位沒有明確相關性。此外，精子頭部未觀察到染色質囊泡化、空心化現象，多發生頂體脫落和損失、頂體外膜膨脹、精子質膜分離以及破裂等，與相關報導中精子頂體異常伴隨著發生染色質異常[43-45]情況不符合。

本研究進一步通過流式細胞儀及頂體染色分析附睪3部位精子頂體熒光強度及頂體完整性差異。流式分析結果顯示，附睪3部位頂體熒光強度無顯著差異；進一步通過頂體染色觀察附睪3部位精子頂體完整性，發現附睪頭部和體部精子頂體不完整集中在一類和二類非完整類型當中，附睪尾部精子頂體完整率最高，表明精子逐漸成熟的過程中，精子頂體完整率隨之升高。結合附睪體部形態較長且細的特征，推測精子從附睪頭部到尾部的過程中，可能受到附睪體部影響，進而頂體完整率提高。此外，有研究表明，附睪中存在巨噬細胞等免疫相關的細胞[46-48]具有吞噬功能，其是否能消除頂體不完整精子也需要進一步的研究。

另外，通過流式分析從附睪頭部到尾部中精子頭部質膜完整率及線粒體膜電位變化，結果顯示，從附睪頭部到尾部，精子頭部質膜完整率逐漸升高，線粒體高膜電位比率增加。已知，精子具有線粒體高膜電位，是線粒體功能完整的特征之一，是具有受精能力的前提。結合CASA分析精子活力結果，本試驗進一步驗證了從附睪頭部到尾部，尾部精子活力逐漸增強。極少有報道精子質膜完整與精子成熟和活力具有相關性，本試驗結果表明，精子頭部質膜完整可能與精子成熟及活力具有一定的相關性，但仍需要進一步的驗證。

4 結 論

本研究主要觀察分析水牛附睪頭、體和尾3部位精子的超微結構、頂體完整性、頭部質膜完整率及線粒體鞘膜電位功能等方面的差異，首次闡述了水牛附睪精子超微形態結構特征，發現水牛附睪頭、體和尾3部位都存在完整的正常精子和不同類型畸形的精子。研究發現水牛精子在附睪成熟過程中活力、質膜完整率、頂體完整率和高線粒體鞘膜電位比率逐漸升高，這說明精子成熟可能與精子頂體完整性、頭部質膜完整率及線粒體膜電位有關。這項研究為探索水牛精子在附睪成熟過程的生殖機理提供了可靠的理論依據。