OPN5對鴨顆粒細胞凋亡、增殖及類固醇激素生成的影響

劉付穗，潘建秋，江丹莉，沈 栩，許丹寧，田允波*，黃運茂*

(1.仲愷農業工程學院，廣州 510225；2.廣東省水禽健康養殖重點實驗室，廣州 510225)

OPN5是2003年首次在哺乳動物神經組織中被發現的一種新型G蛋白偶聯受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)[1-2]，主要在視網膜、下丘腦室旁器(paraventricular organ,PVO)和性腺中表達[3-4]。OPN5是鳥類主要的深腦光感受器(deep-brain photoreceptors,DBPs)之一[2]，參與調控鳥類的繁殖功能[5]。目前發現的DBPs主要有3種，包括黑視蛋白(melanopsin，OPN4)、神經視蛋白(OPN5)、脊椎古視蛋白(vertebra ancient opsin，VAOpn)[6-7]。OPN5是一種對短波長敏感的光色素，吸收波長為360～474 nm，被認為可感受紫外光的絲氨酸蛋白酶，能夠介導光信號傳導[3]。研究表明，OPN5可通過下丘腦-垂體-性腺軸(hypothalamic-pituitary-gonadal axis,HPGA)作用調控鳥類繁殖，其中TSH通路發揮著重要介導作用[8-9]。在長日照繁殖型的揚州鵝中，當OPN5表達升高，鵝產蛋率上升[8]；在非季節性繁殖動物中，當OPN5表達量上升，原雞的睪丸重量升高[2]。目前對OPN5調控繁殖的研究主要集中在下丘腦-垂體層面，而關于OPN5在性腺層面直接調控禽(鳥)類卵泡發育的研究鮮有報道。在鳥類卵泡發育過程中，顆粒細胞發揮重要作用[10]，顆粒細胞的凋亡和增殖直接決定卵泡的發育及成熟[11-14]。研究表明，Caspase和BC1兩大基因家族對細胞凋亡有著重要影響，包括凋亡基因Bax、BAK1、Caspase3及凋亡抑制基因BCl2、BCl6等[12-13]，細胞周期蛋白CyclinD1、CDC20、CDK1等則對細胞增殖發揮重要調節作用[14]。在卵泡發育過程中，垂體FSH和LH通過與其顆粒細胞上的受體FHSR和LHR結合，激活類固醇激素生成通路，生成雌二醇和孕酮等類固醇激素，進而影響卵泡發育、成熟及排卵[10]。也有研究表明，顆粒細胞表達GnRH、GnIH及其受體GnRHR、GnIHR，提示GnRH和GnIH能直接對性腺發揮調控作用[15-16]。本課題組前期研究表明，繁殖期顆粒細胞表達高水平OPN5，但對顆粒細胞的增殖、凋亡和類固醇激素生成有何影響尚不清楚。

本試驗通過在體外培養的鴨顆粒細胞中過表達或干擾OPN5，從正反兩面來研究OPN5對顆粒細胞增殖、凋亡及類固醇激素生成的影響，以期揭示OPN5通過顆粒細胞對卵泡發育的調控機制。

1 材料與方法

1.1 試驗設計及材料

本試驗所用顆粒細胞為180日齡健康山麻鴨等級卵泡顆粒層分離所得。分離鴨顆粒細胞進行原代培養，待細胞匯合度達70%，分別進行OPN5過表達和干擾試驗，均用Lipofectamine 3000試劑(Life Technologies)進行脂質體轉染(n=6)。在OPN5過表達試驗中，過表達組(pEGFP-OPN5組)轉染濃度為1 μg·孔-1pEGFP-OPN5(1.1 kb)重組過表達質粒，空載體組(pcDNA3.1組)轉染濃度為1 μg·孔-1pcDNA3.1(6.1 kb)空載體，空白對照組(NC組)僅添加轉染試劑Lipofectamine3000+P3000。在OPN5干擾試驗中，干擾組(siRNA-OPN5組)轉染5 μL濃度為20 μmoL·L-1的siRNA -OPN5，干擾對照組(siRNA組)轉染5 μL濃度為20 μmoL·L-1siRNA，空白對照組(NC組)僅添加等量的轉染試劑Lipofectamine3000。處理72 h后，檢測并比較過表達和干擾OPN5表達對顆粒細胞凋亡、增殖、相關基因表達和蛋白表達以及細胞生殖激素水平的影響。

1.2 主要試劑與儀器

主要試劑：PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒購于TaKaRa；PowerUPTMSYBRTMGreen Master Mix購于Applied Biosystems；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購于Beyotime；EdU細胞增殖檢測(成相檢測)購于RIBOBIO；anti-OPN5 rabbit購于BBI Life Sciences；Anti-GAPDH antibody ab181602、Anti-Aromatase antibody ab18995購于Abcam；3β-HSD antibody、FITC-goat anti-rabbit IgG購于Affinity Biosciences；Lipofectamine 3000購于Life Technologies；Omega-EndoFree Plasmid Mini KitⅡ購于Omega；Duck E2 ELISA KIT購于CUSABIO；Duck P4/Human INHBELISA KIT購于Elabscience；pEGFP-OPN5(根據XM_021267766.3序列合成質粒)由華大基因科技有限公司合成；pcDNA3.1(貨號：VT9013)購于優寶生物；siRNA-OPN5(根據XM_021267766.3序列設計的siRNA，其中sense：GCAUCAGAUCACAACG-CUUTT；antisense：AAGCGUUGUGAUCUGAU-GCTT)和siRNA -NC(sense：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT；antisense：ACGUGACACGUUC-GGAGAATT)由上海生工生物工程股份有限公司合成。

主要儀器：全波長酶標儀Multiskan GO購于Thermo；恒溫CO2培養箱購于Thermo；QuantStudio 7 Flex型實時熒光定量儀購于Applied Biosystems；倒置熒光顯微鏡購于Olympus；Tanon 5200化學發光成像儀購于上海天能生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 鴨顆粒細胞的分離與培養 選取50只180日齡、體重1.5～2 kg健康山麻鴨蛋鴨，按動物福利原則處死后，采集等級卵泡F1、F2放入裝有2%雙抗的PBS燒杯中，分離顆粒層放入15 mL離心管；顆粒細胞加入5 mL培養基(無血清)，用巴氏吸管反復吹打1 min，500～600 r·min-1離心2～3 min，向離心管內加入5 mL 0.2%Ⅱ型膠原酶，重懸沉淀，置于37 ℃恒溫水浴鍋中消化15～20 min，每5 min震蕩1次。消化結束，加入5 mL M199完全培養基(含10%血清)終止消化，隨后用70 μm細胞篩過濾，收集濾液，1 000 r·min-1離心5 min。M199洗滌沉淀1次，室溫1 000 r·min-1離心5 min；棄上清后加2～3 mL培養液吹打、重懸，每孔接5×105個細胞于12孔細胞培養板，置于39 ℃、5% CO2細胞培養箱中靜置培養。待細胞匯合度達70%，開始試驗處理。

1.3.2 細胞凋亡與增殖水平的檢測 試驗采用Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒與Annexin V-APC/7AAD Apoptosis Detection Kit試劑盒對顆粒細胞的凋亡進行檢測。采用試劑盒Cell-LightTMEdU Apollo 488 In Vitro Kit對顆粒細胞進行細胞增殖檢測。具體操作按照使用說明書進行，對每個處理組進行6次重復，使用3張圖片計算凋亡與增殖細胞比例。

1.3.3 細胞培養液中生殖激素測定 細胞培養液中雌激素、孕酮與抑制素β的測定方法按照ELISA試劑盒說明書進行操作。

1.3.4 基因表達水平檢測 采用TRIzol傳統方法提取組織RNA，并用TaKaRa反轉錄試劑盒反轉錄RNA得到cDNA，采用實時定量PCR (real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)定量測定顆粒細胞中OPN5、TSHβ、FSHR、LHR、GnRHR、GnIHR、GnRH、GnIH、StAR、CYP11A1、3β-HSD、CYP17A1、CYP19A1、Bax、BCl2、BCl6、BAK1、Caspase3、CDC20、CDK1、CyclinD1的mRNA表達水平。根據NCBI上參考序列，利用 Primer 5.0設計以上基因的熒光定量引物和內參β-actin基因引物(表1)，送由上海生工生物工程股份有限公司合成。以cDNA為模板，配制10 μL反應體系：Master Mix 5 μL，上、下游引物各0.1 μL，ddH2O 3.8 μL，cDNA模板1 μL。反應條件設定：50 ℃預變性2 min，95 ℃ 10 min，1個循環；95 ℃ 15 s，退火溫度退火 1 min，40個循環。每個樣品3個 重復，用β-actin作為內參基因進行校正。結果采用相對模板量算法(ΔΔCt法)處理，基因相對表達量用2-ΔΔCt表示。

表1 實時熒光定量PCR引物Table 1 Real-time fluorescence quantitative PCR primers

1.3.5 蛋白表達水平檢測 提取顆粒細胞的總蛋白，用BCA測定總蛋白濃度，SDS變性后，將蛋白上樣于10%的SDS-PAGE膠，電泳80 V 15 min，120 V 60 min。電泳結束后將蛋白轉至PVDF膜200 mA 40 min，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗5次，每次3 min。二抗室溫孵育1 h，TBST洗5次，每次3 min。ECL試劑盒顯色，將膜置于化學發光儀中進行曝光，拍照并保存。采用Image J軟件對Western blot蛋白條帶進行灰度值分析。

1.4 數據統計分析

使用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，P<0.05視為具有顯著性差異，P<0.01視為具有極顯著性差異。

2 結 果

2.1 過表達或干擾OPN5載體在顆粒細胞中的轉染效率

對顆粒細胞轉染過表達OPN5載體，結果顯示(圖1A)，轉染48和72 h后，OPN5表達量較對照組升高分別極顯著升高32.0和126.8倍(P<0.01)，其中轉染72 h后表達更高。對顆粒細胞進行OPN5干擾處理，結果顯示(圖1B)，轉染48 h，siRNA-OPN5處理組OPN5表達量相對于對照組siRNA-NC有所下降，但未達顯著水平(P>0.05)；轉染72 h，siRNA-OPN5處理組的OPN5表達量則極顯著低于對照組siRNA-NC(P<0.01)；轉染48和72 h的干擾效率分別為24%和45%。據此，后續過表達或干擾OPN5的處理均采用轉染72 h。

A.基因相對表達量均按pcDNA3.1=1的標準進行均一化處理；B.基因相對表達量均按siRNA-NC=1的標準進行均一化處理。下同A.Relative gene expressions were homogenized according to the criteria of "pcDNA3.1=1";B.Relative gene expressions were homogenized according to the criteria of "siRNA-NC=1".The same as below圖1 不同處理時間過表達或干擾OPN5對顆粒細胞OPN5轉染效率的影響Fig.1 Effect of overexpression or interference of OPN5 on the transfection efficiency of OPN5 in granulosa cells at different treatment time

2.2 過表達或干擾OPN5對顆粒細胞凋亡的影響

在AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測中(圖2A)，僅綠色熒光染色的為凋亡細胞，綠色和紅色熒光雙染的為壞死細胞，未熒光染色的為正常細胞，結果顯示，過表達和干擾OPN5均明顯影響顆粒細胞的凋亡。流式細胞凋亡檢測結果顯示(圖2B、2C和2D)，與對照組相比，過表達OPN5顯著降低顆粒細胞凋亡數(P<0.05)，干擾OPN5則顯著升高顆粒細胞凋亡數(P<0.05)。AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測結果與流式細胞凋亡檢測結果一致，表明OPN5能抑制顆粒細胞的凋亡。

A.AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測結果(100×)；B.顆粒細胞流式細胞凋亡檢測圖；C、D.流式細胞凋亡結果的統計。*.P<0.05，下同A.Results of AnnexinV-FITC apoptosis assay (100×);B.Flow-through apoptosis assay graph of granulocytes;C,D.Statistics of flow-through apoptosis results.*.P<0.05,the same as below圖2 OPN5對顆粒細胞凋亡水平的影響Fig.2 The effect of OPN5 on granulosa cells apoptosis level

2.3 過表達或干擾OPN5對顆粒細胞增殖的影響

對顆粒細胞增殖情況進行EdU檢測。結果顯示(圖3)，在過表達試驗中，相比pcDNA3.1和NC組，pEGFP-OPN5組的EdU陽性率極顯著升高(P<0.01)，表明過表達OPN5極顯著促進細胞增殖，pcDNA3.1和NC組兩對照組間則差異不顯著。在干擾試驗中，相比于siRNA-NC和NC組，siRNA-OPN5組的EdU陽性率極顯著下降(P<0.01)，表明干擾OPN5表達使細胞增殖明顯受到抑制，siRNA-NC和NC組間則無明顯差異。

A、B.顆粒細胞EdU檢測結果(100×)，EdU(紅色)熒光表明細胞增殖，DAPI(藍色)熒光表示細胞核；C、D.EdU染色細胞比例。**.P<0.01，下同A,B.Granulocyte EdU assay results (100×),EdU (red)fluorescence indicates cell proliferation,DAPI (blue)fluorescence indicates nucleus;C,D.Proportion of EdU-stained cells.**.P<0.01,the same as below圖3 OPN5對顆粒細胞增殖水平的影響Fig.3 The effect of OPN5 on granulosa cells proliferation level

2.4 過表達或干擾OPN5對鴨顆粒細胞凋亡與增殖相關基因表達的影響

檢測顆粒細胞凋亡與增殖相關基因的表達水平。結果顯示(圖4)，OPN5過表達極顯著下調凋亡基因Bax與Caspase3的表達(P<0.01)，顯著或極顯著上調抑制凋亡基因BCl2、BCl6表達(P<0.05或P<0.01)和極顯著上調增殖基因CDC20、CDK1與CyclinD1的表達 (P<0.01)；干擾OPN5對以上基因表達水平的影響均與OPN5過表達的影響結果相反。結果表明，過表達或干擾OPN5能通過影響顆粒細胞凋亡與增殖相關基因的表達來促進或抑制顆粒細胞增殖。

圖4 顆粒細胞凋亡、增殖相關基因表達水平Fig.4 Expression levels of apoptosis and proliferation-related genes in granulosa cells

2.5 過表達或干擾OPN5對顆粒細胞生殖相關基因表達的影響

檢測顆粒細胞生殖相關基因的表達水平。結果顯示(圖5)，轉染OPN5過表達載體能極顯著上調OPN5的表達水平(P<0.01)；OPN5過表達極顯著升高GnRHR、FSHR、LHR的表達量(P<0.01)，也增加TSHβ、GnRH的表達，但未達顯著水平；極顯著抑制GnIH、GnIHR的表達(P<0.01)。干擾OPN5能極顯著抑制OPN5表達，干擾效率達60%；干擾OPN5極顯著降低生殖相關基因GnRH、GnRHR、FSHR、LHR的表達，極顯著增加GnIH、GnIHR的表達(P<0.01)，而對TSHβ的表達則無顯著影響(P>0.05)。

圖5 顆粒細胞生殖相關基因表達水平Fig.5 Expression levels of reproduction-related genes in granulosa cells

2.6 過表達或干擾OPN5對顆粒細胞類固醇激素合成通路的影響

檢測類固醇合成通路相關基因的表達水平。結果顯示(圖6A和6B)，OPN5過表達顯著或極顯著上調類固醇合成通道基因StAR、CYP11A1、3β-HSD、CYP17A1、CYP19A1的表達(P<0.05或P<0.01)；干擾OPN5對以上類固醇合成通道基因的表達產生相反的影響，顯著或極顯著下調StAR、CYP11A1、3β-HSD、CYP17A1的表達(P<0.05或P<0.01)。檢測顆粒細胞OPN5和類固醇合成通路中3β-HSD、CYP19A1因子的表達水平，結果顯示(圖6C和6D)，OPN5過表達顯著上調OPN5、3β-HSD和CYP19A1的蛋白表達(P<0.05)；干擾OPN5則顯著下調OPN5、3β-HSD和CYP19A1的蛋白表達(P<0.05)。所得結果與基因的表達結果相一致。

2.7 過表達或干擾OPN5對鴨顆粒細胞培養液中生殖激素水平的影響

測定細胞培養液中生殖激素水平。結果顯示(圖7)，過表達OPN5極顯著升高細胞液中雌二醇(E2)和孕酮(P4)的水平(P<0.01)，極顯著降低抑制素β(INHβ)的水平(P<0.01)；干擾OPN5則極顯著降低細胞液中E2和P4水平和升高INHβ水平(P<0.01)。結果表明，過表達OPN5促進顆粒細胞分泌E2和P4，抑制INHβ表達和分泌，干擾OPN5則呈現相反的結果。

A、B.過表達或干擾OPN5對類固醇通路相關基因表達水平的影響；C.過表達和干擾OPN5對OPN5、CYP19A1、3β-HSD蛋白表達的Western blot結果；D.過表達和干擾OPN5對OPN5、CYP19A1、3β-HSD蛋白表達的影響A,B.Effect of overexpression and interference with OPN5 on the expression levels of steroid pathway-related genes;C.Western blot results of overexpression and interference with OPN5 on the expression of OPN5,CYP19A1,and 3β-HSD proteins;D.Effect of overexpression and interference with OPN5 on the expression of OPN5,CYP19A1,and 3β-HSD proteins圖6 顆粒細胞類固醇激素合成通路關鍵因子表達水平Fig.6 Expression levels of key factors in the steroid hormone synthesis pathway in granulosa cells

圖7 顆粒細胞培養液中生殖激素水平Fig.7 Reproductive hormone levels in granulocyte cultures

3 討 論

OPN5是深腦光照感受器，能介導光照對禽(鳥)類繁殖活動的調控。國內外對OPN5的研究均圍繞生殖軸上游的下丘腦-垂體層來展開，并且大量研究已表明，OPN5可將光信號傳導至垂體結節(PT)，啟動甲狀腺激素應答(TH-responsive)信號通路[8-9]，通過調節甲狀腺素(T3)的分泌來影響GnRH的生成和分泌[17-18]，從而調控禽(鳥)類繁殖；但是關于OPN5在生殖軸下游性腺層面的直接作用尚未見報道。有研究表明，OPN5在性腺層面有高濃度表達[1-4]，并且主要在顆粒層，這預示OPN5在性腺層對禽(鳥)類的繁殖活性具有直接調控作用。本研究進一步證實了這個結論，并從正反兩方面揭示了OPN5在顆粒細胞中的作用機制。所得結果表明，OPN5除了在生殖軸上游的下丘腦、垂體層面發揮調控作用外，還在性腺層面直接發揮作用。

在禽(鳥)類，主要由顆粒細胞和膜細胞來促進卵泡的發育，其中顆粒細胞是合成P4的重要場所，E2則是由膜細胞和顆粒細胞共同合成[19-20]，E2和P4互相之間存在正反饋調節。雌激素在卵泡發育過程中具有明顯調節作用，可以促進LHR的分化和芳香化酶的合成，從而促進卵泡發育和抑制顆粒細胞凋亡[21-22]。在E2負反饋控制下，INH表達的降低可以使FSH表達水平升高[23]。本研究中，通過檢測過表達或干擾OPN5轉染效率，發現均是72 h 轉染效果最佳，過表達OPN5能夠促進鴨顆粒細胞的增殖，抑制顆粒細胞的凋亡。檢測凋亡和增殖相關基因的表達，發現過表達OPN5顯著抑制細胞凋亡基因Bax與Caspase3的表達，而明顯升高凋亡抑制基因BCl2、BCl6的表達，同時也顯著升高細胞增殖因子CDC20、CDK1與CyclinD1的表達水平。相反，干擾OPN5則明顯抑制顆粒細胞增殖，促進顆粒細胞凋亡，并顯著促進以上凋亡基因的表達，降低細胞凋亡抑制基因和細胞增殖因子的表達。本研究結果從正反兩方面均表明，OPN5能促進體外培養的顆粒細胞增殖，抑制凋亡，提示其可能在性腺通過調控顆粒細胞的增殖和凋亡來影響卵泡的發育，這與相關研究結果相一致。有研究表明，隨著人顆粒細胞的凋亡，細胞凋亡基因Bax、Caspase3表達上升，而凋亡抑制基因BCl2的表達則下降[12]；伴隨著豬顆粒細胞的凋亡，細胞凋亡基因Caspase3表達明顯上升[13]，而當牛顆粒細胞增殖時，細胞增殖因子CDC20、CDK1與CyclinD1表達會明顯上升[14]。還有研究顯示，當小鼠顆粒細胞凋亡時，細胞增殖因子Cyclin D1蛋白表達下調，但細胞凋亡因子Bax的蛋白表達上升[24]；當細胞增殖因子CyclinD1 mRNA水平上升時，雞顆粒細胞的增殖增加[25]。這些結果均提示，當細胞凋亡因子表達增加，凋亡抑制因子和細胞增殖因子表達下降時，會導致細胞凋亡增多，增殖受到抑制；相反，細胞凋亡受抑制，增殖增多時，細胞凋亡因子表達下降，凋亡抑制因子和增殖因子水平均上升。本研究中，當OPN5過表達時，在促進顆粒細胞增殖，抑制其凋亡的同時，相關凋亡因子、凋亡抑制因子及細胞增殖因子的表達變化與以上的結果均一致。

顆粒細胞作為卵泡發育的重要支持細胞，也是類固醇激素生成的主要細胞。在生殖軸調控性腺發育的過程中，尤其是對卵泡發育的影響，下丘腦和垂體層面調控激素均通過與顆粒細胞和膜細胞上特異性受體結合來調控這些細胞的增殖、凋亡及類固醇激素的生成，對卵泡發育產生影響，其中下丘腦GnRH、GnIH和垂體FSH、LH對性腺發育發揮重要調控作用，GnIH能在性腺直接表達并發揮作用。本研究中，過表達OPN5能顯著升高生殖相關基因GnRHR、FSHR、LHR和類固醇生成通道基因StAR、CYP11A1、3β-HSD、CYP17A1、CYP19A1的表達，顯著下調生殖相關基因GnIH、GnIHR的表達，而干擾OPN5則呈現相反的結果。檢測細胞培養液中的類固醇激素水平，發現過表達OPN5能顯著升高E2和P4水平，降低INHβ水平，而干擾OPN5則顯著降低E2和P4水平和升高INHβ水平。本研究結果表明，過表達OPN5可以增加下丘腦和垂體促進繁殖的調控因子對顆粒細胞的作用，并促進顆粒細胞中類固醇激素生成，從而對性腺發育產生影響，而干擾OPN5則進一步從反向印證了這一結論。這些結果與相關的研究報道一致。大量的研究表明，StAR是類固醇激素合成的重要限速酶，其在卵泡發育的各階段均有表達[26]，黃體能否正常產生P4受StAR表達的調控[27]；CYP11A1、CYP19A1與卵泡發育及顆粒細胞成熟有關[28]，CYP19A1敲除小鼠無法合成E2[29]；3β-HSD則可催化產生有活性的P4來調節卵泡的發育進程[30]；CYP17A1可以通過控制雄激素的合成刺激顆粒細胞釋放P4而調控排卵，還能影響早期卵泡發育[31-32]。在體外細胞試驗方面，GnIH的增加能減少顆粒細胞中類固醇激素的釋放，降低LHR和FSHR以及相應類固醇激素合成酶的表達，如StAR、3β-HSD和CYP19A1，會導致E2和P4的分泌減少，并伴隨有顆粒細胞的凋亡，細胞增殖受抑制[11]。另外，也有研究表明，E2和P4可以降低GnIHR的表達，GnIHR的表達量在性成熟的鳥類卵巢中較未性成熟的鳥類更低[33]；在E2的負反饋下，低水平的INH可以使FSH在繁殖期內表達水平升高[19]。

在季節性繁殖禽(鳥)類中，繁殖活動的季節性變化主要受光照控制，不同光照時間或波長在調控動物繁殖活動的同時會導致OPN5表達的升高或降低。有研究表明，延長光照在升高OPN5和TSHβ表達的同時會提高匈牙利白鵝的產蛋率[8]；在白光和紅光照射下，OPN5的表達量會高于藍光和綠光的照射，并會升高揚州鵝產蛋性能[9]。另外，有研究發現，OPN5表達量的降低能顯著抑制鵪鶉TSHβ的表達[34]。在非季節性繁殖禽(鳥)類中，不同的光照處理也會影響繁殖性能，相應OPN5的表達也會升高或降低。研究發現，延長光照時間會促進原雞睪丸發育，OPN5表達量升高，且OPN5的表達對光照反應非常迅速[2]；在山麻鴨上，47 d的觀察期內，24 h光照時長的產蛋率顯著高于18 h[35]。結合以上研究結果，本研究結果提示，OPN5在光照調控禽(鳥)類繁殖活動中發揮了重要的介導作用，也提示其能在生殖軸的3個層面同時發揮對性腺發育的調控作用，但其作用機制及相互關系，目前仍需進一步研究。

4 結 論

OPN5能促進體外培養的鴨卵泡顆粒細胞增殖，抑制其凋亡，通過影響顆粒細胞中類固醇生成通路中相關因子的表達來促進類固醇激素的生成和分泌。