飼喂PRL抑制劑對燕山絨山羊毛囊發(fā)育的影響

張樂超，段春輝，劉月琴，張英杰

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，保定 071000)

山羊絨是由次級毛囊(secondary hair follicle，SF)發(fā)育而來，受光照周期的調(diào)節(jié)呈季節(jié)性生長[1]。毛囊的生長周期分為生長期(5～12月)、退行期(1～2月)和休止期(3～4月)，毛囊周期性再生過程是由毛囊細(xì)胞與各類信號分子交互所致[2-6]，其生長機(jī)制非常復(fù)雜。皮膚是垂體外催乳素(PRL)的重要合成和靶向器官，PRL及其受體(PRLR)表達(dá)于表皮角質(zhì)形成細(xì)胞、皮膚附屬器、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及免疫細(xì)胞中，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與分化、毛囊周期、免疫應(yīng)答等生理過程[7-9]。Foitzik等[10]研究發(fā)現(xiàn)，人毛囊中有豐富的PRL和PRLR，PRL可通過自分泌和旁分泌的方式調(diào)控毛囊周期性變化。研究表明，高濃度的PRL對綿羊休止期的毛囊是一種活動(dòng)信號，促使處于休止期的毛囊進(jìn)入毛發(fā)生長階段，但對處于活動(dòng)狀態(tài)的毛囊有抑制作用[11-12]。小鼠敲除PRLR會(huì)打亂毛發(fā)周期，使毛發(fā)脫落時(shí)間提前，縮短毛囊休止期[13]。這些研究說明，PRL與毛囊周期性有關(guān)，可通過影響毛囊的生長發(fā)育調(diào)控動(dòng)物毛發(fā)的生長與脫落，但關(guān)于PRL調(diào)控毛囊周期性的分子機(jī)制尚不清楚。

本研究在燕山絨山羊次級毛囊生長期(9月份)通過飼喂PRL抑制劑研究PRL對山羊絨生長及毛囊發(fā)育的影響，通過分析相關(guān)激素水平及受體表達(dá)、毛囊性狀，探索PRL影響毛囊發(fā)育的機(jī)制，為揭示次級毛囊再生機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)及時(shí)間

本試驗(yàn)于2019年9-12月在秦皇島青龍利紅絨山羊養(yǎng)殖場進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2019年9月，隨機(jī)選取3月齡體重相近、健康良好的燕山絨山羊公羊20只，試驗(yàn)開始前統(tǒng)一用伊維菌素驅(qū)蟲。試驗(yàn)羊隨機(jī)分為2組(n=10)：對照組和試驗(yàn)組，平均體重為(23.01±4.82)kg，試驗(yàn)期間試驗(yàn)組公羊飼喂PRL抑制劑(溴隱亭，0.06 mg·kg-1)，溴隱亭溶于水中，飼喂前均勻噴灑到飼料中，對照組噴灑等量的水，試驗(yàn)期90 d。飼喂量的選擇依據(jù)Dicks等[14]的結(jié)果(約0.07 mg·kg-1)和溴隱亭說明書(0.05～0.07 mg·kg-1)。

1.3 試驗(yàn)羊的飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)期間試驗(yàn)羊的日糧和飼養(yǎng)管理與羊場其他羊只相同，全舍飼飼養(yǎng)。日糧由蛋白濃縮料、玉米、玉米秸稈組成，組成比例為13.5%、37.8%、48.7%。自由采食和飲水。

1.4 樣品采集

飼喂PRL抑制劑3個(gè)月后，上午07：30(空腹)用5 mL真空促凝管采集兩組試驗(yàn)羊的血液，3 000 r·min-1離心10 min后取血清樣品-20 ℃保存?zhèn)溆谩ＹN皮采集絨毛樣品，放封口袋保存。并用一次性醫(yī)用采樣器(直徑1 cm)采集皮膚組織2塊，一塊放入10%福爾馬林固定液保存，另一塊放入液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 檢測方法

1.5.1 羊絨長度和細(xì)度檢測 用直尺測量羊絨伸直長度，每個(gè)樣品檢測50根[15]。纖維細(xì)度采用全自動(dòng)纖維細(xì)度分析儀BEION F10(上海北昂科學(xué)儀器有限公司)測量，每個(gè)樣品檢測根數(shù)>2 000根，平均3 000根左右。

1.5.2 皮膚組織染色 用HE和Sacpics方法對橫切片進(jìn)行染色[16]。每個(gè)皮膚樣品3個(gè)重復(fù)，每例切片計(jì)數(shù)10個(gè)視野。統(tǒng)計(jì)初級毛囊密度、次級毛囊密度、次級毛囊與初級毛囊比值(S/P)、活性初級毛囊占比和活性次級毛囊占比。

1.5.3 激素濃度測定 將促凝管中的新鮮血液樣品3 000 r·min-1離心10 min，吸取上層血清，用放射免疫試劑盒(南京建成生物工程研究所，中國，南京)測定PRL(0.5～200 ng·mL-1，CV<10%)、IGF-1(3～900 mg·L-1，CV<10%)、MT(10～3 000 ng·L-1，CV<10%)、GH(0.05～20 ng·mL-1，CV<10%)、COR(1～400 ng·mL-1，CV<10%)、T3(0.2～60 ng·mL-1，CV<10%)和T4(5～1 500 ng·mL-1，CV<10%)激素濃度。

1.5.4 皮膚總RNA提取 根據(jù)TransZol Up(Invitrogen，美國)提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測，NanoDrop 2000測定RNA質(zhì)量和濃度，全式金反轉(zhuǎn)錄試劑盒(全式金，北京，中國)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。凝膠電泳圖見圖1，mRNA出現(xiàn)明顯的3條帶，可用于后續(xù)試驗(yàn)分析。

圖1 RNA凝膠電泳圖Fig.1 RNA gel electrophoresis

1.5.5 RT-qPCR檢測皮膚組織PRL、MTNR1a和RORα表達(dá)量 基因引物由華大公司合成，引物信息見表1。使用SYBR Green(寶生物，北京，中國)進(jìn)行qPCR，利用Step One Plus儀器(Applied Biosystems,Carlsbad,CA)進(jìn)行熒光檢測。每孔設(shè)置3個(gè) 重復(fù)。qPCR反應(yīng)體系：正、反引物各0.4 μL，Taq 酶10 μL，模板1 μL，水8.2 μL，共20 μL。qPCR程序：95 ℃ 2 min；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；65～95 ℃，每個(gè)循環(huán)提高0.5 ℃，制作qPCR熔解曲線。

表1 試驗(yàn)引物信息Table 1 Primer information in this study

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SSCP軟件中的student’sT檢驗(yàn)分析羊絨長度、細(xì)度、毛囊數(shù)量、相關(guān)激素和基因的相對表達(dá)量(2-ΔΔCT)，并統(tǒng)計(jì)顯著性(P<0.05)。數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié) 果

2.1 飼喂PRL抑制劑對山羊絨生長和絨毛品質(zhì)的影響

由表2可知，飼喂PRL抑制劑3個(gè)月后對山羊絨伸直長度和細(xì)度無顯著影響(P>0.05)。

表2 飼喂PRL抑制劑對山羊絨生長和絨毛品質(zhì)的影響Table 2 Effects of PRL inhibitor on growth and quality of cashmere

2.2 飼喂PRL抑制劑對絨山羊皮膚毛囊性狀的影響

由圖2可知，飼喂PRL抑制劑3個(gè)月顯著提高了初級毛囊密度(圖3A)、次級毛囊密度(圖3B)、S/P值(圖3C)，并顯著提高了活性初級毛囊占比(圖3D)和活性次級毛囊占比(圖3E)(P<0.05)。

F.皮膚組織HE染色，bar =200 μm；H.皮膚組織Sacpics染色，bar =100 μm。a.初級毛囊；b.次級毛囊；c.活性初級毛囊；d.活性次級毛囊；e.皮脂腺。*.P<0.05，下同F(xiàn).HE staining of skin tissue,bar =200 μm;H.Sacpics staining of skin tissue,bar =100 μm.a.Primary hair follicles;b.Secondary hair follicles;c.Active primary hair follicles;d.Active secondary hair follicles;e.Sebaceous gland.*.P<0.05，the same as below圖2 飼喂PRL抑制劑對皮膚毛囊性狀的影響Fig.2 Effects of PRL inhibitor on skin hair follicles

2.3 飼喂PRL抑制劑對絨山羊血清中PRL、MT、IGF-1、GH、COR、T3和T4的影響

飼喂PRL抑制劑3個(gè)月后對血清PRL、MT、IGF-1、GH、COR、T3和T4濃度無顯著影響(P>0.05，圖3)。

圖3 飼喂PRL抑制劑對絨山羊血清中PRL、MT、IGF-1、GH、COR、T3和T4的影響Fig.3 Effects of PRL inhibitor on serum PRL,MT,IGF-1,GH,COR,T3 and T4 concentrations

2.4 飼喂PRL抑制劑對PRL、MTNR1a和RORα mRNA表達(dá)的影響

由圖4可知，飼喂PRL抑制劑顯著降低了絨山羊皮膚組織PRL(圖4A)和MTNR1a(圖4B)mRNA 表達(dá)水平(P<0.05)，對皮膚組織RORα(圖4C)mRNA表達(dá)量無顯著影響(P>0.05)。

圖4 飼喂PRL抑制劑對PRL、MTNR1a和RORα表達(dá)的影響Fig.4 Effects of PRL inhibitor on PRL,MTNR1a and RORα mRNA levels

3 討 論

3.1 PRL對絨山羊毛囊發(fā)育及山羊絨生長的影響

Foitzik等[17]研究發(fā)現(xiàn)，PRL在毛囊生長期能抑制毛囊的生長，在毛囊由生長期向退行期轉(zhuǎn)變的過程中，PRL的免疫活性上調(diào)，在毛囊生長末期和休止期強(qiáng)烈表達(dá)。另有研究發(fā)現(xiàn)，敲除PRLR小鼠可延長毛囊休止期，并且埋植PRL能使毛囊退行期提前，縮短毛囊生長期[13]。Nixon等[11]發(fā)現(xiàn)，延長光照時(shí)間可使綿羊血清PRL含量升高，次級毛囊提前進(jìn)入退行期，毛囊活性降到2%。以上研究說明，高濃度PRL對毛囊生長有抑制作用，可促使毛囊由生長期向退行期轉(zhuǎn)化。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制PRL 3個(gè)月，處于毛囊生長期的羊絨長度和細(xì)度并未發(fā)生明顯的變化，但試驗(yàn)組絨山羊皮膚中初級毛囊數(shù)量、次級毛囊數(shù)量、S/P值、初級毛囊活性占比和次級毛囊活性占比顯著高于對照組，說明抑制PRL分泌后促進(jìn)了生長期毛囊的發(fā)育，PRL可以調(diào)控毛囊的活化及周期性。

3.2 PRL對血清PRL、MT、IGF-1、GH、COR、T3、T4及皮膚組織MTNR1a和RORα表達(dá)的影響

Dicks等[14]發(fā)現(xiàn)，蘇格蘭絨山羊從1月開始(活化期)每2周在皮下注射35 mg溴隱亭，PRL在第1周 的第4天被顯著抑制，而在第二次注射后的第11天，PRL與對照組無顯著差異，持續(xù)到試驗(yàn)結(jié)束時(shí)的第17周。溴隱亭沒有長期起到抑制PRL分泌的作用，這一現(xiàn)象也在赤鹿和蘇格蘭黑面母羊被發(fā)現(xiàn)[18-19]。另有研究證實(shí)，如果PRL釋放被多巴胺或其激動(dòng)劑抑制，PRL會(huì)在細(xì)胞分解而不分泌[20]。Blask和Orstead[21]利用多巴胺體外培養(yǎng)倉鼠垂體5 h，發(fā)現(xiàn)多巴胺可以降低培養(yǎng)基PRL含量，但不影響垂體3H-PRL(亮氨酸標(biāo)記PRL)合成和免疫活性PRL含量。相反，Steger等[22]發(fā)現(xiàn)，倉鼠在接受長時(shí)間光照處理后，多巴胺并未表現(xiàn)出抑制PRL分泌的作用。這說明多巴胺和其激動(dòng)劑可能在短期調(diào)節(jié)PRL分泌中發(fā)揮重要作用，另一個(gè)可能的解釋是長期的溴隱亭處理下調(diào)了多巴胺受體的表達(dá)，多巴胺抑制作用減弱，使得PRL分泌上升[14]。Curlewis等[18]從2～11月對赤鹿注射溴隱亭，發(fā)現(xiàn)2～4月血清PRL含量雖然低于對照組，但差異不顯著；4月中旬到9月中旬，試驗(yàn)組血清PRL被顯著抑制，10月兩組無顯著差異，11月又出現(xiàn)明顯抑制。這些變化導(dǎo)致粗毛和絨毛生長時(shí)間分別增加了1和3個(gè)月。因此，長期使用溴隱亭，血清PRL濃度先是無變化，然后降低，后又恢復(fù)至對照組水平，這期間的持續(xù)時(shí)間隨著物種的不同而表現(xiàn)出長短的差異。本研究同樣也觀察到，溴隱亭處理3個(gè)月后，燕山絨山羊血清PRL濃度與對照組沒有明顯差異。本研究發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組皮膚組織PRL表達(dá)量顯著低于對照組，且試驗(yàn)組的次級毛囊數(shù)量及活性顯著高于對照組，說明短期抑制PRL分泌后降低了PRL表達(dá)量，也說明皮膚中低PRL表達(dá)可促進(jìn)毛囊活化，并可能會(huì)延長毛囊生長期。

大量研究表明，提高絨山羊血液中褪黑激素(MT)濃度可促進(jìn)山羊絨生長、提高山羊絨產(chǎn)量[23-24]，且PRL與MT濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制PRL 3個(gè)月后，MT濃度沒有明顯變化。但顯著降低了MTNR1a表達(dá)量，對RORα表達(dá)量無顯著影響。MTNR1a是MT膜受體的一種亞型，其表達(dá)分布對于MT功能起到重要作用，主要通過偶聯(lián)G蛋白降低細(xì)胞內(nèi)第二信使cAMP信號[26]。本研究檢測到試驗(yàn)組MTNR1a表達(dá)量顯著低于對照組，說明試驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)酶活性要高于對照組，表明PRL可能通過降低絨山羊皮膚中MTNR1a的表達(dá)提高細(xì)胞內(nèi)酶活性進(jìn)而促進(jìn)毛囊發(fā)育[27-29]。RORα是MT核受體的一種亞型，研究表明，RORα表達(dá)在毛囊生長期晚期較低，退行期晚期上調(diào)，休止期又下降[30]。埋植MT可以提高休止期RORα表達(dá)量，并不影響生長期和退行期的表達(dá)量[31-33]。本研究并未檢測到RORα表達(dá)量發(fā)生顯著變化，說明在次級毛囊生長期RORα可能不是影響次級毛囊生長發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子。

類胰島素生長因子1(IGF-1)是一種多功能細(xì)胞調(diào)控因子，通過在毛囊發(fā)育過程中調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和遷移促進(jìn)毛發(fā)生長[34-35]。綿羊皮膚注射IGF-1可增加角蛋白產(chǎn)生[36]，缺失IGF-1受體的轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚發(fā)育不全，缺少毛囊結(jié)構(gòu)[37]。另有研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1轉(zhuǎn)基因綿羊，羊毛纖維中副皮質(zhì)細(xì)胞增加，導(dǎo)致直徑變大[38]。且缺乏IGF-1患者的頭發(fā)大部分缺乏根鞘，頭發(fā)直徑更細(xì)發(fā)質(zhì)更脆[39]。在體外培養(yǎng)人皮膚毛囊的研究中發(fā)現(xiàn)，10和100 ng·mL-1的IGF-1 可增加毛囊長度，在有10 μg·mL-1胰島素存在的情況下，IGF-1(0.01～100 ng·mL-1)對毛囊生長沒有明顯影響[40]。以上研究說明，在不同物種中IGF-1對維持皮膚功能起重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，在毛囊生長期抑制PRL分泌對IGF-1濃度無顯著影響，說明在山羊絨快速生長期PRL可能不通過IGF-1對毛囊發(fā)育起作用。

皮質(zhì)醇(COR)由腎上腺皮質(zhì)合成和分泌，可調(diào)節(jié)免疫和應(yīng)激反應(yīng)[41]。?gren等[42]發(fā)現(xiàn)，低水平COR可減緩皮膚結(jié)構(gòu)(透明質(zhì)酸和蛋白多糖)的分解，高水平COR可加快這些皮膚結(jié)構(gòu)的分解。Talbott和Kraemer[43]同樣發(fā)現(xiàn)，高水平COR可以對皮膚結(jié)構(gòu)產(chǎn)生副作用。通過促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)促進(jìn)COR合成，可抑制體外培養(yǎng)人毛囊毛干產(chǎn)生，誘導(dǎo)毛囊退化，抑制角質(zhì)細(xì)胞增殖[44]。本研究發(fā)現(xiàn)，在毛囊生長期抑制PRL分泌3個(gè) 月后，對COR濃度無顯著影響，說明長期飼喂PRL抑制劑沒有引起絨山羊的應(yīng)激反應(yīng)，且對絨山羊皮膚無損傷。而COR是否在次級毛囊發(fā)育過程中起作用還有待進(jìn)一步研究。

生長激素(GH)可調(diào)節(jié)機(jī)體的生長、免疫、代謝和生殖等生理功能[45]。研究發(fā)現(xiàn)，GH可在真皮發(fā)揮作用，主要刺激膠原蛋白的合成，Sprague-Dawley小鼠在伽馬射線照射后，皮下注射GH可保護(hù)毛囊不萎縮，真皮和表皮結(jié)構(gòu)完整[46]。Celi等[47]檢測絨山羊血漿GH濃度，發(fā)現(xiàn)GH濃度和季節(jié)無關(guān)，但高GH濃度的公羊脫絨分?jǐn)?shù)要低于低GH濃度的母羊。Alam等[48]發(fā)現(xiàn)，100～200 ng·mL-1的重組GH(rGH)可使人毛囊提早進(jìn)入退行期，顯著提高細(xì)胞內(nèi)IGF-1的免疫活性，且GH可通過自分泌和旁分泌的方式在靶組織中影響IGF-1發(fā)揮生理功能[49]。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制PRL分泌對GH和IGF-1均無顯著影響，說明在毛囊生長期抑制PRL分泌可能不會(huì)通過GH對毛囊發(fā)育起作用。

甲狀腺激素由甲狀腺分泌，可調(diào)節(jié)動(dòng)物機(jī)體的生長發(fā)育、組織分化和物質(zhì)代謝等。甲狀腺激素主要有T3和T4，二者分泌呈季節(jié)性變化[47]。Vidali等[50]用100 pmol·L-1T3和100 nmol·L-1T4分別處理人的毛囊，發(fā)現(xiàn)二者減少了活性氧的形成，增加了活性氧清除劑(過氧化氫酶和超氧化物歧化酶2)的轉(zhuǎn)錄，刺激毛囊角質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生ATP。Villar等[51]發(fā)現(xiàn)，山羊皮膚可發(fā)生甲狀腺激素代謝，且甲狀腺激素代謝與脫碘酶(MD)活性有直接關(guān)系，推測皮膚MD活性可能與羊絨生長有關(guān)；其在絨山羊皮膚組織檢測到了MDII和MDIII，MDII可使T4轉(zhuǎn)化為T3，MDIII可使T3轉(zhuǎn)化為T2、T4轉(zhuǎn)化為rT3，二者活性可能對脫絨模式有影響[51]。Merchant和Riach[52]發(fā)現(xiàn)，高水平的甲狀腺激素可以延遲脫絨時(shí)間和毛囊的活化。Celi等[47]檢測1年甲狀腺激素(T3和T4)水平，發(fā)現(xiàn)T4與PRL有正相關(guān)關(guān)系，T3與脫絨有正相關(guān)關(guān)系，并且在2月份達(dá)到最高水平，11月份達(dá)到最低水平。本研究發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組和對照組T3和T4并沒有顯著差異，說明在山羊絨生長期抑制PRL分泌對甲狀腺激素分泌無顯著影響。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果顯示，PRL可調(diào)控絨山羊毛囊的發(fā)育，在絨山羊毛囊生長期抑制PRL分泌可促進(jìn)毛囊發(fā)育，提高毛囊數(shù)量和活性毛囊比例，且皮膚中PRL和MTNR1a基因在PRL調(diào)控毛囊發(fā)育中起重要作用。