雞Ii結合Rab5a和Rab7b分子的分析

陳芳芳，桂亞萍，于鳳梅，張 俊，談 陽，李錦春，劉翠艷，查麗莎

(安徽農業大學動物分子與應用免疫創新團隊，合肥 230036)

恒定鏈(invariant chain,Ii)是一種非多態的Ⅱ型跨膜蛋白。Ii參與主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex,MHC)Ⅱ類分子的裝配、成熟和轉運，在內吞體中協助MHC Ⅱ類分子進行抗原肽加工和提呈；后來發現，Ii還可以協助MHC Ⅰ類分子對抗原肽的轉運，即Ii參與了抗原的交叉遞呈[1-3]。Ii還是適應性免疫的多功能調節器，如負責將MHCⅠ類和Ⅱ類分子以及其他Ii相關分子(如Fc受體)分選進入特定的內吞體途徑和調節B細胞的發育和成熟等[3-6]。Ii的活性片段可攜帶抗原肽在細胞內吞體中分別與MHCⅠ類和Ⅱ類分子共定位和結合，參與抗原遞呈，這個特性使Ii活性片段作為疫苗載體可以直接進入內吞體途徑，易化抗原在細胞內的轉運[7]。所以，以Ii為載體的疫苗得到廣泛應用[8-9]。此外，Ii還是一些細胞因子和病毒的受體[10-13]。這些功能的發現和應用均與Ii在細胞中的定位有關，尤其是在內吞體中的定位。當Ii表達時，內吞體的成熟和蛋白酶降解被延遲，在一些非抗原提呈細胞內，內吞體增大，其機制與內吞體中SNARE[soluble N-ethylmaleimide sensitive-factor(NSF)attachment protein (SNAP)receptor]蛋白的Vti1b有關[14]。

Rab是介導細胞內分子轉運的重要家族，它們分布于真核細胞所有與漿膜相關的細胞器(如細胞核、高爾基體和內吞體等)，在細胞器間轉運活性蛋白過程中起重要作用，其中，Rab5a是介導細胞吞噬過程的必要調節蛋白，對抗原及抗原遞呈分子的轉運具有重要作用。研究發現其影響MHC Ⅱ類分子對抗原肽的遞呈，應用辛伐他汀可以抑制這種作用[15-17]。Rab7b在哺乳動物中主要定位于晚期內吞體、溶酶體和高爾基體。其不僅參與胞內活性蛋白從早期內吞體到晚期內吞體/溶酶體的轉運，而且還是內吞體到高爾基體或/和跨高爾基體系統(trans-Golgi network,TGN)的重要調節蛋白[18-19]。

課題組此前發現雞Ii可以分別與Rab5a和Rab7b結合，并在細胞內與之共定位[20-21]。但是并不清楚在Ii的多個結構域中與Rab分子結合以及在細胞定位中的作用。為此，本研究構建了Ii的不同結構域片段以及Ii突變體，探明它們與Rab5a和Rab7b結合和共定位的特性，以進一步解析Ii在免疫反應中細胞內轉運機制。

1 材料與方法

1.1 主要試驗材料

PCR plus mix、DNA Marker DL2000、質粒提取試劑盒、限制性內切酶和蛋白Marker購自東盛生物(廣州)有限公司；T4連接酶購自東洋紡(日本)有限公司；轉染試劑lipo8000購自碧云天(上海)有限公司；廣譜彩虹預染蛋白Marker購自康為世紀(北京)有限公司；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和DMEM培養基購自Hyclone(美國)有限公司；鎳柱、Gluttathione Sepharose 4B柱和電化學發光(electrogenerated chemiluminescence,ECL)試劑盒購自GE(瑞士)有限公司；小鼠抗GFP、RFP、His抗體和酶標記山羊抗鼠抗體購自中杉金橋(北京)有限公司；重組質粒pmCherry-C1、pEGFP-C1、pEGFP-C1-cIi、pGEX-4T-1、pET-32a-cIi、pGEX-4T-1-cRab5a、pGEX-4T-1-cRab7b、pmCherry-C1-cRab5a、pmCherry-C1-cRab7b、人胚胎腎細胞系293 T細胞和大腸桿菌(E.coli)Rostta(DE3)菌株由本實驗室保存。

1.2 Ii功能域和Ii突變體基因的擴增

用自行設計的引物，以實驗室保存的含有cIi質粒為模板，分別克隆含Ii胞漿區和跨膜區結構域的cIi(Cyt-Tra)和含構成內質網腔區的CLIP和三聚體區的cIi(CLIP-TRIM)；同時，應用重疊延伸PCR法獲得3個Ii突變體cIi(M81-87aa)、cIi(M91-99aa)和cIi(M81-99aa)，突變范圍在CLIP片段內，分別為突變CLIP的81-87位(M81-87aa)、91-99位(M91-99aa)和81-99位(M81-99aa)氨基酸。PCR和重疊延伸方法參照陳芳芳等[21]。

1.3 重組質粒的構建和鑒定

利用雙酶切方法分別將上述克隆的5個基因片段定向插入真核和原核表達載體pEGFP-C1和pET-32a中，構建相應的重組質粒。然后轉化至感受態細胞Rosetta(DE3)中，分別構建含6個真核表達質粒和6個原核質粒的重組菌Rosetta(DE3)pEGFP-C1-cIi(M81-87aa)、Rosetta(DE3)pEGFP-C1-cIi(M91-99aa)、Rosetta(DE3)pEGFP-C1-cIi(M81-99aa)、Rosetta(DE3)pEGFP-C1-cIi(Cyt-Tra)、Rosetta(DE3)pEGFP-C1-cIi(CLIP-TRIM)、Rosetta(DE3)pEGFP-C1、Rosetta(DE3)pET-32a-cIi(M81-87aa)、Rosetta(DE3)pET-32a-cIi(M91-99aa)、Rosetta(DE3)pET-32a-cIi(M81-99aa)、Rosetta(DE3)pET-32a-cIi(Cyt-Tra)和Rosetta(DE3)pET-32a-cIi(CLIP-TRIM)以及對照的空載體Rosetta(DE3)pET-32a。構建的重組菌經PCR和酶切初步鑒定后送擎科(南京)生物公司測序。質粒構建和鑒定的方法同陳芳芳等[21]。本研究中所用引物、基因序列和構建的重組質粒名稱見表1。

1.4 真核轉染和激光共聚焦觀察

將構建的含有綠色熒光的重組質粒與本實驗室保存的帶有紅色熒光的重組質粒pmCherry-C1-cRab5a和pmCherry-C1-cRab7b分別共轉染293 T細胞。繼續培養24 h后用PBS清洗。4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗3次后封片，在LSM 880 with Airyscan激光共聚焦顯微鏡觀察真核重組質粒共轉染后在細胞內的共定位。同時為了驗證轉染的重組質粒在細胞內蛋白的表達，應用Western blot進行蛋白的特異性鑒定。細胞轉染、觀察和鑒定的方法同陳芳芳等[21]。

1.5 原核重組菌的蛋白表達與鑒定

將上述經鑒定正確的原核重組表達菌和本實驗室保存的重組菌Rosetta(DE3)pGEX-4T-1-cRab7b、Rosetta(DE3)pGEX-4T-1-cRab5a和Rosetta(DE3)pGEX-4T-1進行蛋白表達、純化和鑒定。重組菌用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside,IPTG)0.5 mmol·L-1，16 ℃進行誘導表達24 h。離心收集的菌體用180 W，5 s，間隔10 s超聲波破碎菌體，12 000g離心15 min，上清中的蛋白用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)進行電泳和染色觀察。His和GST標簽的蛋白分別用鎳柱和GST親和層析柱(glutathione sepharose 4B)進行純化，純化后蛋白用SDS-PAGE電泳進行鑒定。

1.6 拉下法(Pull-down)檢測目的蛋白間的結合

將帶有GST標簽蛋白的GST/cRab5a、GST/cRab7b、GST蛋白分別加入GST親和層析柱內作為錨定蛋白，放入4 ℃冰箱內平衡30 min左右，將攜帶His標簽的蛋白His/cIi、His/cIi(M81-87aa)、His/cIi(M91-99aa)、His/cIi(M81-99aa)、His/cIi(Cyt-Tra)、His/cIi(CLIP-TRIM)以及His分別加入柱內，孵育1 h后用10 mmol·L-1谷胱甘肽洗脫液洗脫，收集蛋白洗脫液，分別進行SDS-PAGE凝膠電泳，根據電泳條帶和免疫印跡法的特異性鑒定結果判定蛋白間有無相互作用關系。具體操作方法同陳芳芳等[21]。

2 結 果

2.1 Ii功能域和突變體基因的克隆及其鑒定

首先，應用PCR和重疊延伸擴增技術獲得了5個目的基因片段，在瓊脂糖核酸凝膠電泳檢測中，cIi(M81-87aa)、cIi(M91-99aa)和cIi(M81-99aa)大小均為672 bp(圖1泳道1、3、5)，cIi(Cyt-Tra)和cIi(CLIP-TRIM)大小分別為258和450 bp(圖1泳道7、9)，這些擴增產物大小與預期一致。其次，將這些片段插入相應載體，構建成重組質粒，經雙酶切鑒定，其產物在相應泳道中均出現預期大小的片段(圖1泳道2、4、6、8和10)。

M.DNA相對分子質量標準；1、3、5、7、9.PCR產物；2、4、6、8、10.質粒Xho I/EcoR I 雙酶切產物M.DNA marker;1,3,5,7,9.PCR amplified proudct;2,4,6,8,10.Recombinant plasmids digested with Xho I and EcoR I圖1 基因的擴增和重組質粒雙酶切鑒定Fig.1 Amplification of genes and identification of recombinant plasmids by restriction endonuclease digestion

2.2 真核表達的Ii結構域、Ii突變體與Rab5a和Rab7b的細胞內共定位

為確定所構建的重組質粒在細胞內的定位特性，將含綠色熒光的重組質粒pEGFP-C1-cIi、pEGFP-C1-cIi(M81-87aa)、pEGFP-C1-cIi(M91-99aa)、pEGFP-C1-cIi(M81-99aa)、pEGFP-C1-cIi(Cyt-Tra)、pEGFP-C1-cIi(CLIP-TRIM)、pEGFP-C1與含紅色熒光蛋白的重組質粒pmCherry-C1-cRab5a(或者pmCherry-C1-cRab7b)共轉染293 T細胞。應用免疫印跡法進行蛋白質特異性的鑒定。結果顯示，細胞內表達的重組綠色熒光蛋白/紅色熒光蛋白分別被抗GFP/RFP抗體所識別，出現與預期大小相符合的條帶(圖2A、B)，這說明所構建的重組蛋白在細胞內得到表達。在激光共聚焦顯微鏡下檢測相關目的蛋白的共定位關系(圖3)。對照組GFP/cIi與RFP/cRab5a(或RFP/cRab7b)定位于細胞內同一部位而在疊加圖中呈現黃色(圖3A、B中a)；同樣，GFP/cIi(M81-87aa)、GFP/cIi(M91-99aa)、GFP/cIi(M81-99aa)、GFP/cIi(Cyt-Tra)也均與RFP/cRab5a(或RFP/cRab7b)在細胞內共定位而呈現黃色(圖3A和3B b、c、d和e)；GFP/cIi(CLIP-TRIM)均勻分布于整個細胞(圖3A、B f)，而空載體GFP則更多定位于細胞核，兩者在疊加圖中均不顯示出與RFP/cRab5a(或RFP/cRab7b)共定位的黃色(圖3A、B g)。以上結果表明，Ii、cIi(Cyt-Tra)及Ii突變體均可以與cRab5a或cRab7b在細胞內共定位，而CLIP與三聚體[cIi(CLIP-TRIM)]卻不能。

圖2 Ii功能域、Ii突變體、Rab5a和Rab7b分子真核表達蛋白的鑒定Fig.2 Identification of Ii domain，its mutants,Rab5a and Rab7b in eukaryotic expression

GFP.綠色熒光蛋白；RFP.紅色熒光蛋白；標尺=50 μm；箭頭所指為關聯分子的共定位GFP.Green fluorescent protein;RFP.Red fluorescent protein;Bar=50 μm;the arrows show the co-localization of associated molecules圖3 cIi突變體和功能域與Rab5a和Rab7b在真核細胞的共定位Fig.3 Colocalization of mutant and functional domain cIi with Rab5a and Rab7b in eukaryotic cells

2.3 原核表達的Ii結構域、Ii突變體重組質粒的蛋白表達與純化

構建的重組菌Rosetta(DE3)pET-32a-cIi(M81-87aa)、Rosetta(DE3)pET-32a-cIi(M91-99aa)、Rosetta(DE3)pET-32a-cIi(M81-99aa)和空載體重組菌Rosetta(DE3)pET-32a進行蛋白的表達和純化，如圖所示，它們表達的蛋白His/cIi(M81-87aa)、His/cIi(M91-99aa)、His/cIi(M81-99aa)和His/cIi分子量相近分別為46.2 ku，而His蛋白大小為22 ku(圖4A泳道 2、3、4、1和5)。而Rosetta(DE3)pET-32a-cIi(CLIP-TRIM)和Rosetta(DE3)pET-32a-cIi(Cyt-Tra)表達的蛋白大小分別為38.5和31.1 ku(圖4B泳道 1和2)，所表達的蛋白大小與預期相符合，這表明所構建的重組質粒可以正確表達目的蛋白。

圖4 cIi突變體與功能域原核表達蛋白的純化Fig.4 Purification of prokaryotic expression protein of Ii mutant and functional domain

2.4 原核表達的Ii結構域、Ii突變體結合Rab5a和Rab7b特征的確定

為了解析Ii突變體[His/cIi(M81-87aa)、His/cIi(M91-99aa)和His/cIi(M81-99aa)]與cRab5a/7b的相互作用關系，應用Pull-down方法進行檢測。GST/cRab5a、GST/cRab7b和GST分別作為錨定蛋白，GST或者帶GST標簽的蛋白可以與填料結合而留在柱內，當后加入的His標簽蛋白的樣品中存在與其結合的部分則隨之被留在柱內，最后被解離液洗脫下來。如果沒有與其結合的蛋白則最后解離液中只有單一的GST/cRab5a、GST/cRab7b或GST蛋白存在。

每組均以經證實的His/cIi與GST/cRab5a(或者GST/cRab7b)作為陽性對照，先檢測His/cIi(M81-87aa)的結合特性。結果發現，當GST/cRab5a(或者GST/cRab7b)先結合在親和層析柱時，后加入柱子中的His/cIi和His/cIi(M81-87aa)可以與GST/cRab5a(或者GST/cRab7b)結合而在解離液中出現兩個條帶，分別是His/cIi與GST/cRab5a(或者GST/cRab7b)和His/cIi(M81-87aa)與GST/cRab5a(或者GST/cRab7b)(圖5A、B的泳道2、3)，且解離條帶與相應蛋白條帶大小一致(圖5A、B的泳道5、6)，His空載體不與其相結合而出現單一條帶(圖5A、B的泳道4)。對照組的GST與His/cIi、His/cIi(M81-87aa)共同孵育時，僅出現GST標簽蛋白的單一條帶(圖5A和B的泳道8、9)。進一步應用抗His的抗體對相應蛋白進行檢測，結果發現，在相應泳道出現特異性條帶(圖5A、B的泳道2、3、5、6和7)。用相同的方法和步驟檢測了His/cIi(M91-99aa)和His/cIi(M81-99aa)分別與GST/cRab5a(或者GST/cRab7b)的結合。結果發現，它們的解離液中均出現2條帶，分別是GST/cRab5a(或者GST/cRab7b)和His/cIi(M91-99aa)(或者His/cIi(M81-99aa))(圖6A、B的泳道2、3)，且解離條帶與相應蛋白條帶大小一致(圖6A、B的泳道4、5)，而對照組均為標簽蛋白GST的單一蛋白條帶(圖6A、B的泳道6、7)。

圖5 His/cIi(M81-87aa)和GST/cRab5a與GST/cRab7b結合的鑒定Fig.5 Identification of binding of His/cIi(M81-87aa)with GST/cRab5a and GST/cRab7b

圖6 His/cIi(M91-99aa)和His/cIi(M81-99aa)與GST/cRab5a和GST/cRab7b蛋白質相互作用的鑒定Fig.6 Identification of binding of His/cIi(M91-99aa)and His/cIi(M81-99aa)with GST/cRab5a and GST/cRab7b proteins

以上結果表明，Ii突變體均可以與GST/cRab5a(或者GST/cRab7b)結合，且這種結合不受標簽蛋白的影響。這說明，Ii突變體也可以與Rab5a和Rab7b結合，Ii的CLIP區域不是其結合的主要結構域。

2.5 cIi結合Rab5a和Rab7b功能域的確定

進一步應用相同方法驗證His/cIi(Cyt-Tra)和His/cIi(CLIP-TRIM)與GST/cRab5a(或者GST/cRab7b)結合。SDS-PAGE結果顯示，在解離液中出現兩個條帶，分別是His/cIi(Cyt-Tra)和GST/cRab5a(或者GST/cRab7b)(圖7A、B泳道2)，與對應的蛋白條帶大小一致(圖7A、B泳道3)，而His/cIi(CLIP-TRIM)不能與之結合，在電泳圖中僅有一條條帶(圖7A、B泳道4)，對照組中的GST亦不能與His/cIi(Cyt-Tra)或His/cIi(CLIP-TRIM)結合(圖7A、B泳道6、7)。這說明Ii與Rab5a(或者Rab7b)結合的功能域是胞漿區和跨膜區，不是CLIP和三聚體區。

圖7 His/cIi(Cyt-Tra)和His/cIi(CLIP-TRIM)與GST/cRab5a和GST/cRab7b結合的鑒定Fig.7 Identification of binding of His/cIi(Cyt-tra)and His/cIi(CLIP-TRIM)with GST/cRab5a and GST/cRab7b

3 討 論

本研究應用拉下法檢測了關聯蛋白Ii結合Rab5a或Rab7b的分子特征。該法曾在課題組檢測Ii與MHC分子結合中得到驗證[7]；還應用激光共聚焦顯微鏡觀察了Ii與Rab分子在細胞內共定位的特征。課題組曾在前期工作中應用細胞器定位蛋白檢測Rab5a或Rab7b在細胞內分布，發現它們均定位于細胞內吞體[20-21]。本研究結果(圖3)表明，Ii(包括Ii胞漿區和跨膜區片段)能與Rab分子在內吞體共定位。總之，本研究獲得了以下重要結果。

首先，Ii的胞漿區和跨膜區不僅能結合Rab分子，還是細胞內定位的功能結構域。雞Ii由3個結構域組成，分別是胞漿區、跨膜區和內質網腔區。其中，內質網腔區由CLIP(81—107 aa)和三聚體區組成。項目組前期研究發現，Ii的跨膜區和胞漿區具有引導抗原肽進入內吞體的功能[7]。在本研究中，這兩個結構域分別具有結合Rab5a和Rab7b的功能(圖7)；更重要的是，由于Ii只有在細胞內遷移中，才能發揮其從裝配成熟MHC Ⅱ類分子到協助提呈外源性抗原肽不同功能，而Rab分子是胞內轉運蛋白，所以，這兩類分子的結合和在細胞內的共定位，不僅表明Rab分子參與Ii的胞內遷移，也提示Ii分解成胞漿區和跨膜區在遷移過程中可能存在其他重要功能，如研究發現，其可遷移到細胞核進而誘導細胞核轉錄因子的釋放，并影響B細胞受體信號的轉導[22]。此外，由于課題組在用細胞器定位的研究中已表明，Rab5a和Rab7b均定位于內吞體[20-21]，所以，Ii與Ii的胞漿區和跨膜區片段分別與這兩種分子共定位(圖2)，表明它們均可進入內吞體。

其次，本研究結果表明，Ii的CLIP盡管與結合Rab分子無關，但是對Ii分子在細胞定位是不可缺失的，它是保持空間結構的關鍵片段。Ii和MHC Ⅱ類分子在內質網中形成九聚體，期間Ii的CLIP占據MHC Ⅱ類分子凹槽，在遷移至內吞體后，Ii 被分解，抗原肽取代CLIP，與MHC Ⅱ類分子形成MHC-抗原肽復合物，最后被提呈給T細胞產生免疫應答。在此過程中，CLIP是重要結構域[23]。課題組前期研究發現，缺失部分CLIP片段的Ii[cIi(D81-87aa)和cIi(D91-99aa)]，盡管還能維持結合Rab5a的特性，卻改變了其在細胞內的定位，即缺失后的Ii分布于整個細胞，而不是細胞質[20]，但是不清楚這種細胞定位的改變是否由于CLIP片段缺失導致的空間結構變化。由于CLIP分子量較小，難以在體外形成空間結構，故本研究通過突變CLIP的關鍵位點[cIi(M81-87aa)、cIi(M91-99aa)和cIi(M91-99aa)]，探明上述問題。結果表明，突變CLIP后的Ii仍定位于細胞質，這提示Ii的CLIP對維持其在細胞內定位至關重要，由于Ii胞漿區和跨膜區具有結合Rab5a或Rab7b功能，故3個Ii突變體均維持與Rab分子結合。

4 結 論

本研究結果表明，Ii的胞漿區和跨膜區不僅能結合Rab5a或Rab7b分子，還是其在細胞內定位的功能結構域。Ii的CLIP與結合Rab5a或Rab7b分子無關，卻是保持Ii分子空間結構和維持細胞內定位特性的關鍵片段。