新疆牛、羊和駱駝源產志賀毒素大腸埃希菌的系統進化分群、血清群與毒力基因及耐藥性分析

佟盼盼，張萌萌，陳文霞，劉璐瑤，張 凌，唐雪林，蘇戰強，謝金鑫

(新疆農業大學動物醫學學院，烏魯木齊 830052)

產志賀毒素大腸埃希菌(Shiga toxin-producingE.coli，STEC)是全球公認的食源性致病菌，人類感染后可引起無血性腹瀉、出血性結腸炎(hemorrhagic colitis，HC)、溶血性尿毒癥綜合征(hemolytic uremic syndrome，HUS)及血小板減少性紫癜(thrombocytopenic purpura，TTP)等[1]，不同毒力基因的組合與致病力密切相關[2]。

STEC的主要毒力因子志賀毒素(Shiga toxin，Stx)由噬菌體上的stx編碼，可抑制宿主細胞蛋白質的合成，包括stx1和stx2，其中stx1基因由3個亞型(stx1a、stx1c和stx1d)組成，stx2基因由7個亞型(stx2a～stx2g)組成[3]。不同亞型或亞型組合可能與疾病的嚴重程度有關[3-4]。流行病學研究表明，產生stx2a-、stx2c-和stx2d-的STEC菌株往往比攜帶其他stx亞型的菌株更頻繁地從HC和HUS患者中分離出來[5]。另一個重要的毒力因子緊密黏附素由其毒力島LEE上的eae基因編碼，介導細菌定殖和黏附到宿主腸細胞上，在發病機制中發揮重要作用[6]。此外，溶血素基因(hlyA)也與STEC的致病性密切相關，常與腹瀉病和HUS相關[7-8]。這些毒力因子以單一或多種組合形式構成一種特定病原體的毒力特征。

STEC主要通過糞-口途徑傳播，食用未經煮熟的肉制品、未洗凈的蔬菜和未經巴氏滅菌的乳制品是人類感染STEC的最主要途徑[9-10]。2017年，歐盟報告了6 073例STEC感染病例，據分析，相較于O157非O157血清群感染比例有所增加[11]。牛是STEC的天然宿主，但研究發現羊、駱駝等反芻動物也是STEC的攜帶者[12-13]。在國內，有關非O157 STEC在牛、牦牛和綿羊上流行的報道較多，而關于駱駝源分離株的報道尚不多見[14-16]。本研究收集牛、羊和駱駝源非O157 STEC菌株，對其進行大腸埃希菌系統進化分群、血清群、毒力基因及耐藥性分析，評估這些STEC潛在的風險，為STEC監測和分子流行病學研究提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 菌株

2018—2019年，從新疆烏魯木齊、阿勒泰、伊犁、哈密、巴音郭楞蒙古自治州(巴州)、阿克蘇、喀什及和田的養殖場、屠宰場和市場收集牛、羊和駱駝糞便、肛拭子和胴體樣品共2 312份，經分離鑒定獲得94株非O157 STEC(表1)，用含有終濃度15%甘油的生理鹽水保菌，并儲存于-80 ℃，從最初分離限次傳代以確保其遺傳穩定性。

表1 94株牛、羊和駱駝源非O157 STEC分離株的背景信息Table 1 Background information of 94 non-O157 STEC isolates from cattle,sheep and camels

1.2 主要試劑

Thermo PCR反應試劑(2×Taq PCR Green Mix)和Gelgreen(Biotium)購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；藥敏片購自杭州濱和微生物試劑有限責任公司；EC肉湯、腦心浸液肉湯(BHI)、麥康凱培養基(MAC)、MH肉湯和MH瓊脂購自青島海博生物科技有限公司；藥敏質控標準菌株大腸埃希菌ATCC 25922由本實驗室保存。系統進化分群、血清群及毒力基因引物均由上海生工生物工程科技服務有限公司合成。

1.3 系統進化分群

將保存的STEC在BHI中復蘇，劃線接種MAC平板，37 ℃培養16～18 h，取單菌落煮沸裂解制備DNA。按照Clermont等[17]報道的方法對非O157 STEC分離株進行系統進化群(A、B1、B2、C、D、E和F)。第一步是四重PCR擴增chuA、yjaA、arpA、TSPE4.C2基因片段，根據結果分為A或C、D或E、B1、C、F、B2和E群。當四重PCR不能區分A和C或D和E群時，通過第二步PCR擴增trpAgpC或ArpAgpE基因片段進一步確定C或E群。

四重PCR反應體系：12.5 μL Taq Master Mix，1 μL細菌DNA模板，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，加入ddH2O至25 μL。反應程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃ 10 s，57 ℃(E群)或59 ℃(四重組和C群)20 s，72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃延伸10 min。

1.4 O血清群鑒定

參照文獻[18]采用多重PCR(E.coliO-genotyping PCR)篩選O血清群，用162對引物建立20個多重PCR組(6～9對引物/組)，擴增條帶大小明顯不同。PCR混合物包含10 μL 5 × GoldStar PCR Buffer，1 μL 10 mmol·L-1dNTP Mix，2.5 U GoldStar Best DNA聚合酶，每條引物(10 μmol·L-1)0.5 μL，3 μL 細菌DNA模板，加入ddH2O至50 μL。反應程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃延伸10 min。

1.5 毒力基因檢測

參考文獻[19]報道的序列和PCR條件，合成毒力基因eae和hlyA引物，以兩種基因各自測序菌株為陽性對照，以大腸埃希菌ATCC 25922為陰性對照。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將eae和hlyA陽性擴增產物送至上海生工生物工程有限責任公司進行測序，通過BLAST分析測序結果并統計各菌株毒力基因的攜帶情況。

1.6 志賀毒素基因亞型檢測

采用Scheutz等[3]所述的PCR方法檢測stx1和stx2基因亞型，包括stx1a、stx1b、stx1c、stx2a、stx2b、stx2c、stx2d、stx2e、stx2f、stx2g。以10種基因各自測序菌株為陽性對照，以大腸埃希菌ATCC 25922為陰性對照。三重PCR擴增stx1亞型，反應體系：12.5 μL Master mix，stx1a、stx1c和stx1d上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，1.5 μL細菌DNA模板，加入ddH2O至25 μL。多重PCR擴增stx2亞型，包括10 μL 5×GoldStar PCR Buffer，1 μL 10 mmol·L-1dNTP Mix，2.5 U GoldStar Best DNA聚合酶，每條引物(10 μmol·L-1)0.5 μL，2 μL細菌DNA模板，加入ddH2O至50 μL。反應程序：95 ℃預變性3 min；94 ℃ 30 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃延伸10 min。為明確同時攜帶stx23個亞型的菌株，在66 ℃下進行PCR驗證。

1.7 藥物敏感性試驗

參照CLSI標準[20]，以大腸埃希菌ATCC 25922為質控菌株，采用K-B紙片法對94株STEC進行藥物敏感性檢測。18種藥敏片：氨芐西林、哌拉西林、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢吡肟、氨曲南、阿莫西林/克拉維酸、哌拉西林-他唑巴坦、氨芐西林-舒巴坦、慶大霉素、阿米卡星、復方新諾明、氯霉素、左氧氟沙星、環丙沙星、鏈霉素、四環素和多黏菌素B。將菌株接種于MH平板，37 ℃，培養16～18 h。挑取單菌落接種于2 mL MH培養基中，37 ℃，培養4～5 h。無菌棉簽蘸取菌液均勻涂布在MH平板上，用滅菌鑷子夾取藥敏片貼于平板上，倒置，37 ℃，培養16～18 h，記錄結果。根據藥敏試驗結果，將對三類(每類中一種或以上)或三類以上抗菌藥物同時耐藥的菌株判定為多重耐藥菌[21]。

1.8 ERIC-PCR基因分型

根據Versalovic等[22]報道的方法合成ERIC-PCR引物，對不同動物相同O血清群STEC進行PCR擴增。反應體系：12.5 μL Taq Master Mix，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，1 μL細菌DNA模板，加入ddH2O至25 μL。反應程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃ 30 s，56.5 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35個循環；72 ℃延伸10 min。

1.9 菌株同源性判斷

采用BioNumerics軟件進行UPGMA(unweighted pair group method using arithmetic averages)聚類分析，條帶位置差異容許度選擇1.5%。優化值選擇1.5%。如果相似性指數≥85%，則認為菌株具有遺傳相關性[23]。

1.10 數據分析

采用IBM SPSS Statistics 21.0進行數據分析。單因素分析采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 菌株的系統進化分群

94株非O157 STEC系統進化分群可分為3群，分別為B1群(83/94，88.3%)、E群(7/94，7.4%)和A群(4/94，4.3%)。牛、羊及駱駝源分離株均以B1群為主(牛源52/57，91.2%；羊源24/25，96.0%；駱駝源7/12，58.3%)，E群主要為駱駝源STEC(5/7，71.4%)，4株A群屬于牛源分離株。

2.2 菌株的O血清群鑒定

94株STEC中未檢測出O157血清群，其中37株 可確定O血清群，占分離株的39.4%，共檢出9個血清群，包括O146(n=14)、O22(n=7)、O3(n=4)、O168(n=4)、O8(n=3)、O167(n=2)、O88(n=1)、O112ab(n=1)和O147(n=1)。

2.3 菌株的毒力基因及志賀毒素基因亞型檢測

部分STEC的毒力基因及stx基因亞型檢測結果如圖1所示。

在94株STEC分離株中，46.8%(44株)僅攜帶stx1，6.4%(6株)僅攜帶stx2，46.8%(44株)同時攜帶stx1+stx2；80.9%(76株)攜帶hlyA，9.6%(9株)攜帶eaeA(表2)。羊源和駱駝源STEC均以攜帶stx1+hlyA為主(分別為68.0%和25.0%)，牛源STEC以攜帶stx1+stx2+hlyA為主(57.9%)。毒力基因組合stx1+stx2+eaeA(1株)和stx2+eaeA+hlyA(1株)僅存在于駱駝源STEC。1株牛源和2株駱駝源STEC攜帶stx1+stx2+eaeA+hlyA(表3)。

表2 非O157 STEC毒力基因及亞型檢測結果Table 2 Virulence genes and subtypes of non-O157 STEC

stx基因亞型檢測結果顯示，牛、羊和駱駝攜帶的stx基因亞型包括stx1a、stx1c、stx2a和stx2d(圖1c～f)。stx1a主要分布在牛源STEC中，與駱駝源相比，差異顯著(P<0.05)。stx1c主要分布在羊源STEC中，駱駝源次之，牛源最少，三者之間相比，差異顯著(P<0.05)(表3)。

表3 非O157 STEC的毒力基因譜Table 3 Virulence gene profiles of non-O157 STEC

2.4 菌株的藥物敏感性測定

藥敏試驗結果表明，94株非O157 STEC中14株(14.9%)為耐藥菌(表4)。對頭孢他啶、四環素、頭孢噻肟、氨芐西林、氨曲南的耐藥率為3.2%～5.3%，對復方新諾明、頭孢吡肟、哌拉西林-他唑巴坦、氨芐西林-舒巴坦、阿莫西林-克拉維酸、多黏菌素B的耐藥率為1.1%～2.1%。未檢測出多重耐藥菌，但有2株對β-內酰胺類抗生素的多個藥物耐藥。

表4 14株非O157 STEC的耐藥表型Table 4 Drug resistance phenotypes of 14 non-O157 STEC isolates

2.5 菌株的ERIC-PCR基因分型結果

對24株血清群為O8、O22和O146的牛、羊和駱駝源STEC進行ERIC-PCR基因分型，可分為A、B和C3簇，以B簇為主，各簇之間相似性指數≥ 85%，親緣關系較近(圖2)。不同地區相同或不同動物源的菌株存在相同的指紋圖譜，如YS10(羊)和TS12(羊)，AC10(駱駝)、UB18(牛)和YS10(羊)。同一地區從牛場糞便、肛拭子到胴體拭子來源的菌株也存在相同的指紋圖譜。如UB8(糞便)、UB40(肛拭子)和UB12(胴體拭子)。

a.hlyA；b.eaeA；c.stx1a；d.stx1c；e.stx2a；f.stx2d；1～3.STEC分離株；4.陽性對照；M.DL2000 DNA相對分子質量標準；N.陰性對照a.hlyA;b.eaeA;c.stx1a;d.stx1c;e.stx2a;f.stx2d;1-3.STEC isolates;4.Positive control;M.DNA marker;N.Negative control圖1 hlyA、eaeA、stx1a、stx1c、stx2a和stx2d基因PCR擴增產物Fig.1 PCR products of hlyA,eaeA,stx1a,stx1c,stx2a and stx2d genes

3 討 論

本研究對新疆牛、羊和駱駝源非O157 STEC進行了相對全面的分析。系統進化分群顯示牛、羊和駱駝源非O157 STEC均以B1群為主，這與國外報道的牛、羊和駱駝源非O157 STEC的分群結果一致[21-23]。本研究共鑒定出9個血清群，其中5個血清群O8、O22、O88、O147和O167分布于駱駝源STEC，表明駱駝源STEC攜帶的O血清群更多樣化。在牛上經常發現O血清群未知的STEC[24]，本研究中O血清群未知的STEC也主要集中于牛源分離株(71.9%，41/57)。據2017年歐盟的報告顯示，在羊源STEC中O157、O146和O38血清群最為常見，其中O157、O146可引起人類感染[11]，本研究中羊源STEC以O146血清群為主，應引起足夠的重視。薛濤等[14]在江蘇某牛場發現STEC分離株的優勢血清型為O4、O26和O93，顧叢叢等[16]在江蘇某羊場發現STEC分離株的優勢血清型為O93，表明不同省份動物源STEC攜帶優勢O血清型不同。

TET.Tetracycline;AMP.Ampicillin;TZP.Piperacillin-Tazobactam;CAZ.Ceftazidime;AZM.Ammonia-tronan;STX.Cotrimoxazole;CTX.Cefotaxime;PB.Polymyxin B;A/C.Amoxicillin-Clavulanate;FEP.Cefepime;SAM.Ampicillin-Sulbactam圖2 非O157 STEC的ERIC-PCR 基因分型及UPGMA聚類分析Fig.2 Results of ERIC-PCR genotyping and UPGMA clustering of non-O157 STEC

STEC的致病性及其導致的臨床癥狀與毒力基因密切相關[25]。臨床上經常從腹瀉或HUS患者中分離到同時攜帶eae和stx2基因的STEC，eae基因與引起人類HUS疾病的STEC菌株關系密切[24]。本研究中1株駱駝源STEC同時攜帶eae和stx2基因，且eae基因在駱駝源STEC中的檢出率最高(P<0.05)，然而關于駱駝源STEC毒力和致病性的研究相對較少。本研究中羊源STEC均未攜帶eae基因，在江蘇羊源STEC分離株中也很少出現eae基因[16]。作者發現牛源STEC的毒力基因譜最為多樣化(占所有毒力組合的80%)，且以攜帶stx1+stx2+hlyA(57.9%)為主(表2)，表明stx編碼的噬菌體在牛上廣泛傳播。本研究中，stx1a主要分布于牛源STEC，stx1c主要分布于羊源STEC，表明不同stx基因亞型可能與宿主動物種類相關。stx2基因是從HUS患者分離的STEC中發現的最普遍的毒素基因型，但攜帶不同stx2亞型的STEC與HUS的相關性存在顯著差異[5]，其中stx2a和stx2d與HC、HUS關系密切[26-27]。本研究中，stx2a主要分布于牛源分離株，stx2d常見于牛、羊源STEC[28]，41.7%駱駝源STEC攜帶stx2d(5/12)，表明駱駝也是stx2d的儲存庫。

近年來，動物源非O157 STEC的耐藥性逐漸增強，本研究中STEC耐藥株集中在牛源分離株上，其耐藥率(17.5%，10/57)高于先前新疆牛源非O157 STEC的耐藥率(11.5%)[29]，且50%的牛源STEC對四環素耐藥，這與Dong等[30]的研究結果一致。本研究中的STEC多對1～2種抗生素耐藥，總體上耐藥率不高，多重耐藥不嚴重(14.9%，14/94)，但這些菌株中存在對β-內酰胺類的多個藥物耐藥的現象，甚至出現對多黏菌素耐藥的菌株，提示在臨床上需謹慎用藥。ERIC-PCR技術因操作簡單、快速、準確而得到了廣泛應用，擴增的目的條帶為腸桿菌基因間ERIC序列，這些序列具有高度的同源性。鄭曉風等[31]采用ERIC-PCR方法分析牛源和羊源的非O157 STEC之間的親緣關系較近。本研究利用ERIC-PCR分型結果顯示，不同地區的牛、羊和駱駝源的非O157 STEC之間親緣關系較近，預示著STEC的傳播不局限于同一地區，也可能通過動物的轉場在不同地區不同物種間交叉傳播。

4 結 論

從牛、羊、駱駝的糞便、肛拭子和胴體上分離的非O157 STEC血清群豐富，毒力基因譜多樣化，且具有一定的耐藥性，這些菌株潛在感染人類的風險，因此，不僅需要持續監測，而且要制定干預這些菌株污染肉品的方案，從而最大限度地降低非O157 STEC感染人類的風險。