中藥成分辛弗林對膠體金免疫層析法檢測β-受體激動劑的影響

王子琳，唐子恒，林澤寧，劉文字，劉 戎，張嘉慧，沈祥廣*

(1.華南農業大學 國家獸藥殘留基準實驗室，廣州 510642；2.農業農村部畜禽產品質量監督檢驗測試中心(廣州)，廣州 510642)

β-受體激動劑引起的食品安全問題是全世界關注的熱點。在食品動物飼養中，由于高劑量的β-受體激動劑可以加快脂肪的分解，提高動物的瘦肉率[1-2]，個別廠家非法將其添加至飼料中來提高食品動物的經濟效益[3]。如今，β-受體激動劑作為促生長劑已在全球大約160個國家被禁止使用，包括中國、俄羅斯和部分歐洲國家等[4]。膠體金免疫層析法(colloidal gold immunochromatographic assay,CGIA)具有方便、易操作、低成本、適用性強等特點[5]，因此常用于檢測動物組織或尿液中克倫特羅(clenbuterol，CLE)、沙丁胺醇(salbutamol,SAL)和萊克多巴胺(ractopamine,RAC)3種β-受體激動劑(下文稱3種β-受體激動劑)等化合物，以確保動物源性食品的質量安全。

在國家倡導減抗養殖的背景下，許多養殖場會使用中獸藥粉末或中藥制劑進行疾病防控。例如在豬的飼料中添加杜仲、黨參、陳皮等中藥粉具有促進豬只生長、增強免疫功能、提高酮體性能等方面作用[6-9]。在使用CGIA法檢測3種β-受體激動劑的過程中，有時會出現CGIA檢測呈陽性(即CLE、RAC、SAL至少有1種檢測呈陽性)，液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)復測時呈現未檢出的結果，即假陽性現象，針對這一現象的解釋和研究較少。筆者在前期試驗中發現，105種中藥材中，陳皮、青皮、木瓜、厚樸、紅景天5種中藥的提取物β-受體激動劑CGIA檢測呈陽性，而在中藥飼喂動物試驗中，僅有飼喂了陳皮、青皮2種中藥后的豬尿液CGIA檢測出現RAC陽性反應。陽性豬尿經LC-MS/MS復測，未檢出RAC[10]。陳皮和青皮均含有一個中藥成分—辛弗林(synephrine，SYN)，可能是引起豬只尿液CGIA檢測3種β-受體激動劑出現假陽性的關鍵成分。為進一步驗證陳皮、青皮、木瓜、厚樸、紅景天5種中藥對CGIA法檢測β-受體激動劑的影響，本試驗采用LC-MS/MS法和小鼠肝微粒體體外模型，研究辛弗林對CGIA法檢測3種β-受體激動劑的影響，以期為獸醫臨床合理使用中藥提供參考，減少由中藥源引起的“瘦肉精”CGIA 檢測假陽性現象的發生。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

辛弗林標準品購于上海源葉生物科技有限公司。受試中藥購于廣州南北行中藥飲片有限公司。甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)和甲酸(色譜純)購于賽默飛世爾科技(中國)有限公司。小鼠肝微粒體(ICR/CD1)購于瑞德肝臟疾病研究(上海)有限公司。CLE、RAC、SAL 3種膠體金免疫層析檢測卡購于北京勤邦生物科技有限公司。液相色譜串聯質譜儀，型號Agilent 1290 Infinity Ⅱ搭配Agilent 6470 Triple Quad LC/MS，購于美國安捷倫科技有限公司。

1.2 溶液及配制

辛弗林標準儲備液：精密稱取5.10 mg辛弗林標準品(98%)，置于5 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，制成濃度為1 mg·mL-1的辛弗林儲備液，-20 ℃保存；儲備液使用前以超純水稀釋成不同濃度的辛弗林標準工作液，4 ℃保存。PBS緩沖液(pH=7.4)：取磷酸二氫鉀1.36 g，加入0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液79 mL，用純水稀釋至200 mL。100單位六磷酸葡萄糖脫氫酶：取0.41 mg六磷酸葡萄糖脫氫酶(241 U·mg-1)，用5 mmol·L-1檸檬酸鈉溶液定容至2.5 mL，-80 ℃保存。co-factors溶液：取200 mg NADP+，200 mg六磷酸葡萄糖，133 mg氯化鎂，用雙蒸水定容至10 mL，-20 ℃下保存。

1.3 液相色譜串聯質譜法檢測中藥提取復溶液和豬尿中的辛弗林

1.3.1 豬尿中辛弗林的測定

1.3.1.1 液相色譜及質譜條件:

a)色譜條件 色譜柱：Luna C18(2)(150 mm × 2.0 mm，5 μm)；流速：0.25 mL·min-1；柱溫：35 ℃；進樣量：5 μL。流動相：流動相A為0.1%甲酸溶液，流動相B為0.1%甲酸乙腈，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序表Table 1 Mobile phase elution gradient

表2 辛弗林的質譜分析參數Table 2 Mass spectrometric analysis parameters of synephrine

1.3.1.2 豬尿樣品前處理:取豬尿0.5 mL，加入乙腈9.5 mL，渦旋1 min，密閉，40 ℃水浴超聲30 min，2 800×g離心5 min，取離心后的上清液5 mL，氮吹至干，取0.5 mL流動相復溶，過0.22 μm微孔濾膜，進液相色譜-串聯質譜儀檢測。

1.3.1.3 基質匹配標準曲線和線性范圍:取空白豬尿，按上述步驟前處理獲得的空白豬尿基質，將標準工作液稀釋成不同濃度，繪制基質匹配標準曲線，求出回歸方程和相關系數。

1.3.1.4 回收率和變異系數：移取空白豬尿0.5 mL若干份，分別加入濃度為0.5、2.5和5.0 μg·mL-1的辛弗林標準工作液100 μL，制成添加濃度為0.1、0.5和1.0 μg·mL-1的空白添加樣品。按“1.3.1.2”方法處理，重復3批，計算回收率和變異系數。

1.3.1.5 測定：取飼喂中藥后CGIA檢測β-受體激動劑呈陽性的豬尿樣品6份，該豬尿為前期動物飼喂試驗中對105種中藥進行篩查獲得的飼喂了陳皮和青皮的豬尿；陳皮和青皮按每只豬每天50 g的使用量(約為《中華人民共和國獸藥典》推薦劑量的5倍)，連續給藥3 d，于給藥后約6 h接取的豬尿。取豬尿0.5 mL，按“1.3.1.2”方法處理，進液相色譜-串聯質譜儀分析辛弗林含量。采用外標法，以基質匹配標準曲線方程定量。

1.3.2 中藥提取復溶液中的辛弗林含量測定 精密量取100 μg·mL-1辛弗林標準工作液適量，用流動相稀釋成不同濃度的標準溶液，每個濃度3個重復，繪制標準曲線，求出回歸方程和相關系數。

分別取陳皮、青皮、木瓜、厚樸、紅景天5種中藥粉末2 g，各作3個平行樣。加乙醇-乙腈(1∶9，v/v)10 mL提取并濃縮[10]，復溶液過濾后用流動相稀釋，進液相色譜-串聯質譜分析辛弗林含量。采用外標法，以標準曲線方程定量，測定中藥提取復溶液中辛弗林的濃度。

1.4 小鼠肝微粒體對中藥CGIA檢測陽性成分的影響

出現假陽性的中藥提取復溶液以雙蒸水稀釋至CGIA檢測RAC呈陽性臨界濃度的10倍，備用。辛弗林添加陽性樣品：取CGIA法檢測β-受體激動劑呈陰性的2種中藥復溶液，分別添加適量辛弗林標準工作液(PBS稀釋)，用雙蒸水稀釋至CGIA檢測RAC呈陽性臨界濃度的10倍，備用。

將小鼠肝微粒體置37 ℃水浴解凍。于2 mL EP管中，將640 μL雙蒸水、100 μL PBS緩沖液(pH=7.4)、100 μL備用液和100 μL小鼠肝微粒體混合(反應體系中的蛋白濃度為2 mg·mL-1)，置37 ℃水浴預孵育3 min后，分別加入10 μL 100單位六磷酸葡萄糖脫氫酶溶液和50 μL co-factors溶液，啟動反應，繼續置37 ℃水浴中孵育。在啟動反應后的0、1、2、3、4、5、6 h取樣進行膠體金免疫層析檢測。每組3個平行。

對照試驗：取100 μL PBS緩沖液代替備用液，與640 μL雙蒸水、100 μLPBS緩沖液和100 μL小鼠肝微粒體混合制成不含中藥的對照；取100 μL 重懸緩沖液代替小鼠肝微粒體，與640 μL雙蒸水，100 μL PBS緩沖液和100 μL 備用液混合制成不含肝微粒體的對照。

2 結 果

2.1 辛弗林液相色譜串聯質譜檢測法的建立

2.1.1 標準曲線和線性范圍 空白豬尿基質匹配標準曲線在線性范圍10～1 000 ng·mL-1，相關系數(r)為0.999 5，線性關系良好。

2.1.2 回收率和變異系數 在0.1、0.5和1.0 μg·mL-13個添加濃度水平，豬尿中辛弗林的回收率為72.3%～95.0%，批內變異系數為2.5%～12.6%，批間變異系數為7.3%～13.8%。

2.2 CGIA檢測陽性樣品的辛弗林含量測定

當PBS中辛弗林濃度為0.8 μg·mL-1時，β-受 體激動劑CGIA檢測仍呈陽性反應(RAC陽性)，進一步稀釋呈陰性；取多份 CGIA 檢測陰性的豬尿添加辛弗林標準工作液，制成含不同濃度的辛弗林添加豬尿，進行 CGIA 檢測，結果發現，當豬尿中辛弗林濃度為 0.2 μg·mL-1時，RAC仍呈陽性反應，進一步稀釋呈陰性。

液相色譜-串聯質譜法分析結果表明，飼喂了陳皮和青皮的豬尿液均檢出了辛弗林，平均濃度分別為1.36和1.65 μg·mL-1，飼喂厚樸、木瓜和紅景天的豬只尿液未檢出辛弗林。在陳皮和青皮的提取復溶液中，辛弗林的平均濃度分別為132.6 和312.7 μg·mL-1；而在厚樸、木瓜和紅景天3種中藥的提取復溶液中均未檢出辛弗林。

2.3 CGIA檢測陽性的中藥復溶液與小鼠肝微粒體的孵育結果

木瓜、厚樸復溶液和小鼠肝微粒體混合反應后，0、1 h的CGIA檢測呈RAC陽性結果，2～6 h的CGIA檢測結果為RAC逐漸轉為陰性。陳皮、青皮復溶液和小鼠肝微粒體混合后，0～6 h 的CGIA檢測結果均呈RAC陽性。

陰性中藥木香和山藥的復溶液制備的辛弗林添加陽性樣品與小鼠肝微粒體混合反應后，0～6 h的CGIA檢測結果均為RAC陽性。木香和山藥的復溶液經肝微粒體孵育后，0～6 h的CGIA檢測均呈陰性。

對照試驗的結果：不含中藥對照試驗樣液0～6 h CGIA檢測均呈陰性；不含肝微粒體的假陽性中藥對照試驗樣液0～6 h的CGIA檢測均呈陽性。

紅景天的提取復溶液用雙蒸水稀釋5倍后即顯陰性，在體系中無法達到CGIA檢測靈敏度，未進一步測試。

3 討 論

3.1 辛弗林引起的CGIA檢測β-受體激動劑假陽性

特異性單克隆抗體具有特異性強，靈敏度高等特點，并被廣泛應用至膠體金免疫層析試紙條的制作上，試紙條檢測的特異性也依賴于單克隆抗體的識別[11]。試驗中使用的膠體金免疫層析檢測卡為專門檢測豬尿中CLE、RAC和SAL的試紙條，其在設計時可能是主要以豬尿為抗原和抗體的生理液基質進行開發，這可能是辛弗林在PBS緩沖液中和在豬尿中CGIA檢測靈敏度不同的原因。

辛弗林，又稱脫氧腎上腺素，是一種存在于陳皮、青皮等柑橘類植物果實的中藥成分，具有加速體內脂肪氧化等作用，如圖1所示，其分子結構與RAC較為接近，針對RAC的單克隆抗體可能會誤識別辛弗林為目標抗原并與之結合，從而出現CGIA檢測β-受體激動劑假陽性的現象。

圖1 沙丁胺醇(a)、克倫特羅(b)、萊克多巴胺(c)、辛弗林(d)結構式對比Fig.1 Structure comparison of salbutamol(a),clenbuterol(b),ractopamine(c)and synephrine(d)

試驗中，采用液相色譜-串聯質譜法分析，陳皮和青皮的提取復溶液以及飼喂豬收集的尿液均能檢出辛弗林，且濃度均高于CGIA的檢測低限，而木瓜、厚樸、紅景天的提取復溶液以及飼喂豬收集的尿液均未檢出辛弗林。試驗結果表明，中藥成分辛弗林能引起CGIA檢測RAC顯假陽性，而木瓜、厚樸、紅景天提取物中引起CGIA檢測β-受體激動劑顯假陽性的成分并非辛弗林，具體的成分確證仍需進一步研究。

3.2 體外模型中小鼠肝微粒體對中藥CGIA檢測陽性成分代謝

與化學合成藥物不同，中藥的成分較多，與機體的相互作用較復雜[12]，同一種中藥，不同產地、生長時間等因素都會影響成分的變化。采用小鼠肝微粒體體外模型，可以研究動物機體的肝酶系統對藥物的代謝作用。陳皮、青皮、木瓜、厚樸、紅景天5種中藥雖然直接提取CGIA檢測均呈陽性，但引起假陽性的成分可能不同。試驗中顯示，木瓜和厚樸的假陽性干擾成分能被小鼠肝微粒體代謝成非陽性物質，提示該2種中藥的陽性成分可能在動物體內被代謝，豬尿顯陰性；而紅景天的假陽性成分可能是濃度或活性較低，在豬尿中未達到有效檢測濃度。在木瓜、厚樸、紅景天3種中藥中，引起β-受體激動劑CGIA檢測的化學物質鑒定有待進一步探索；中藥成分辛弗林難以被小鼠肝微粒體代謝，提示陳皮和青皮中的辛弗林成分被動物吸收后在尿中形成較高濃度，導致CGIA檢測β-受體激動劑出現假陽性。

4 結 論

豬飼喂陳皮和青皮后引起豬尿CGIA檢測β-受體激動劑出現假陽性與陳皮和青皮中含有的中藥辛弗林成分有關。陳皮、青皮、厚樸、木瓜和紅景天5種中藥均含有CGIA檢測β-受體激動劑假陽性成分，但僅陳皮和青皮含有辛弗林。厚樸和木瓜的假陽性成分可被小鼠微粒體代謝消除，陳皮和青皮中含有的假陽性成分辛弗林難以被小鼠微粒體代謝消除。