環保視角下糞便堆肥用微生物研究方法效果及進展

綿陽師范學院 冀紅柳

隨著我國國民肉類消耗的增加，畜禽養殖規模擴大帶來的糞便污染問題日益嚴重[1]。畜禽糞便不僅會對海陸空造成污染，同時也會引起畜禽乃至人類的一些疾病[2]。但從資源的角度看待糞便，其中又含有巨大的價值，糞便經合理處理后可作為肥料、飼料及能源等[3]。本文綜合閱讀近年來關于堆肥微生物研究的文獻，對各種方法進行了總結分類，初步總結了目前糞便堆肥微生物的研究方法。

一、糞便堆肥微生物的組成

糞便堆肥的過程分為初期、高溫期、降溫期，在不同的堆肥時期，各種微生物相互交替演變、繁殖生長，共同作用完成堆肥過程。

（一）細菌

細菌菌群為糞便堆肥整個過程的優勢菌群，堆肥初期嗜溫細菌為主要菌群，隨著溫度的上升，細菌菌群也在不斷演變。

（二）真菌

真菌對溫度很敏感，最適溫度在25-30℃，多數真菌為嗜溫真菌，比如曲霉和木霉等。

（三）放線菌

放線菌對纖維素、半纖維素有一定的降解能力，在高溫下可以孢子形式存活，所以抗逆性比真菌更好。

二、影響糞便堆肥微生物作用效果的主要因素

糞便堆肥進程的速度及效果受微生物的作用影響。微生物的生長繁殖、消耗合成等過程會被很多因素所影響，包括CN、PH值、含水量、通氣量、溫度等，這些因素可升高或降低微生物合成酶的速度、微生物代謝快慢等。

（一）溫度

在糞便的堆肥過程中，溫度是一個重要指標。我國《農業廢棄物無害化處理標準》規定，需要在55℃條件下持續3天以上或50-55℃條件下5-7天，才能滿足無害化處理要求。為了保證堆肥產品的質量，堆體的溫度最好維持在45-65℃。

（二）通氣量

不論是糞便的好氧堆肥還是厭氧堆肥，通氣量都是一個很重要的因素。主要影響兩個方面：第一，適當的通氣量帶走堆體中過多的溫度，溫度超過68℃會影響嗜熱菌群的活性。第二，通氣量不達標就會造成厭氧環境，從而影響好氧堆肥進程。

（三）C/N

C/N是堆肥過程中評價堆肥程度的一個重要指標。有機C是微生物生長的重要能量來源，通過微生物作用將糞便中的一些物質轉化為CO2和腐殖質。有機N是微生物的營養來源，一部分被微生物吸收作為營養，一部分轉化為惡臭氣體的主要來源氨氣，剩余的絕大部分進行了硝化作用。C/N需要保持一定的比例，有機C過高會導致微生物對堆體降解的時間過長，有機N過高不利于微生物的生長繁殖，同時還會產生大量惡臭氣體等。堆肥初始C/N一般保持在20-35。

（四）PH值

在堆肥過程中，認為PH值一般保持為7.0~7.5，這個范圍適合微生物的生長繁殖，有利于糞便堆肥的進行。酸性環境可減少N以氨氣的形式損失，提高N含量，有利于堆肥產品的質量。

（五）含水量

水是很重要的載體，糞便堆肥微生物所需很多營養物質都需要溶于水才能被分解吸收。含水量不適宜會影響微生物生長代謝繁殖，含水量過高會造成堆肥縫隙被填滿以致氧氣循環受阻、產生酸臭味，導致養分損失及環境二次污染，含水量不足時會影響微生物對有機物的分解吸收，造成堆體發酵不充分。

三、不同方法對堆肥微生物及其效果的研究現狀

（一）傳統稀釋培養分離法

傳統的稀釋分離培養是根據需分離培養微生物的性質來選擇相應的培養基進行分離培養的，然后用顯微鏡來觀察菌類的形態特征、生理生化特征及數量來研究環境微生物的多樣性。

（二）磷脂脂肪酸甲酯法（PLFA）

磷脂脂肪酸作為生物標記，可以定量地分析菌群數量和群落結構，具有應用范圍廣，適用于土壤、水、腐殖質等微生物中的檢測；可迅速處理多種樣品；精準測量樣品中生物量；避免傳統培養分離方法引起的計數不足等問題。但同時此方法也有不足之處，首先，對磷脂脂肪酸的掌握不充分，不能把檢測到的數據與微生物對應；其次，無法將生物群落組成與功能相聯系；最后，磷脂脂肪酸的合成與微生物的生長繁殖環境密切相關，比如濕度、溫度、PH等。

（三）分子生物學技術

研究微生物的多樣性一般是直接從環境樣品中提取DNA或RNA，然后對其進行PCR擴增再采用多種技術來鑒定比如說變性梯度凝膠電泳 、末端限制性片段長度多態性以及高通量測序等。PCR片段擴增采用的目的片段一般選擇相對保守又能區分不同菌群的，例如細菌一般采用16S rRNA，具有的優點為多拷貝、多信息、長度適中等。近些年來分子生物學不斷地成熟與發展，加速我們更深層次更全面的了解糞便堆肥微生物。我們希望基于分子生物學來獲得糞便堆肥微生物的種類和多樣性、特定時間活躍的菌群以及功能及潛在功能。常用的一些技術包括但不限于DGGE、T-RFLP、高通量測序、宏組學、單細胞水平研究等方法。

1.變性梯度凝膠電泳（DGGE）

DGGE是研究微生物采用最早的分子生物學技術，具有分辨率高、成本低、應用方便等優點，缺點是會被DNA的提取、PCR的擴增乃至引物設計等過程影響而測量分析的微生物群落豐度要>1%。

2.末端限制性片段長度多態性（T-RFLP）

限制性長度多態性（RFLP）是由于糞便堆肥過程中出現的不同微生物種群基因不同，具有各自的限制性酶切位點，利用DNA酶進行酶切后電泳會產生各自相應的條帶，可利用這些條帶進行群落多樣性、結構和重組質進行內切酶酶切后，會出現4-6條片段，增加了鑒定的復雜性，因此這種方法適用于分析微生物群落的不同階段。為了彌補這些不足，在RFLP基礎上對PCR擴增過程中的末端特異性引物進行熒光標記，再進行后續酶切、電泳等操作，即末端限制性片段長度多態性（T-RFLP）。

3.高通量測序

高通量測序具有通量大、準確率高、操作相對簡單等優點，逐漸被廣泛應用于環境微生物的檢測分析。最常用的方法是利用Illumina Miseq 高通量測序技術對樣品的16S rRNA的相關區域分析。采用高通量分析技術，對豬糞高溫堆肥的初始階段、高溫階段、腐熟階段樣品的16S rDNA V4～V5 可變區序列進行測序分析，在升溫期和高溫期優勢門均為厚壁菌門，而腐熟期優勢門為放線菌門，該方法準確分析豬糞堆肥過程中微生物群落結構的演替，為堆肥過程添加外源菌劑促進堆肥過程的進行提供了理論依據。

4.宏組學

宏組學是指宏基因組學、宏轉錄組學及宏蛋白組學等。宏基因組是特定環境樣品中的全部基因，這種研究方法的研究對象為真菌和細菌基因組的DNA，解決了環境樣品中大部分微生物不能分離培養的難題。宏基因組學無法在特定的環境下表達微生物群落基因的變化，而宏轉錄組學彌補了這一問題。宏轉錄組是在特定的環境、時空中微生物全部轉錄體的總和。

5.單細胞水平研究

我們已經能夠從群落水平認識微生物的分類、結構組成等方面，但一直很難從單細胞水平認識群落中的微生物。隨著單細胞水平的研究逐漸深入，我們從最初的放射自顯影技術（Microautoradiography，MAR） 到 現 如今拉曼光譜學顯微技術（Raman spectroscopy，Raman）以及納米二次離子質 譜（Nano-scale secondary ion mass spectrometry，nanoSIMS)，后兩者分辨力非常高，可達到納米級別。

四、結語

微生物在糞便堆肥及資源化利用過程中有著十分重要的地位。在微生物群落演替，不同菌類的作用效果、發現更加高效的菌類和研制新型外源微生物添加劑，都離不開對微生物的研究。在傳統微生物研究方法的基礎，隨著分子生物學的不斷更迭發展，對微生物擁有了更加深層次的認識。另外，在研究過程中我們不能只局限于一種方法，各種方法都有優缺點，應選擇合適的研究方法與技術相組合。

相關鏈接

微生物包括：細菌、病毒、真菌以及一些小型的原生生物、顯微藻類等在內的一大類生物群體，它個體微小，與人類關系密切。涵蓋了有益跟有害的眾多種類，廣泛涉及食品、醫藥、工農業、環保、體育等諸多領域。在我國教科書中，將微生物劃分為以下8大類：細菌、病毒、真菌、放線菌、立克次氏體、支原體、衣原體、螺旋體。有些微生物是肉眼可以看見的，像屬于真菌的蘑菇、靈芝、香菇等。還有微生物是一類由核酸和蛋白質等少數幾種成分組成的“非細胞生物”。肉眼難以看清，需要借助光學顯微鏡或電子顯微鏡才能觀察到的一切微小生物的總稱。微生物包括細菌、病毒、真菌和少數藻類等。（但有些微生物是肉眼可以看見的，像屬于真菌的蘑菇、靈芝等。）病毒是一類由核酸和蛋白質等少數幾種成分組成的“非細胞生物”，但是它的生存必須依賴于活細胞。根據存在的不同環境分為空間微生物、海洋微生物等，按照細胞結構分類分為原核微生物和真核微生物。一個體積恒定的物體，被切割的越小，其相對表面積越大。微生物體積很小，如一個典型的球菌，其體積約1mm3，可是其表面積卻很大。這個特征也是賦予微生物其他如代謝快等特性的基礎。

相比于大型動物，微生物具有極高的生長繁殖速度。大腸桿菌能夠在12.5-20分鐘內繁殖1次。不妨計算一下，1個大腸桿菌假設20分鐘分裂1次，1小時3次，1晝夜24小時分裂24×3=72次，大概可產生4722366500萬億個（2的72次方），這是非常巨大的數字。但事實上，由于各種條件的限制，如營養缺失、競爭加劇、生存環境惡化等原因，微生物無法完全達到這種指數級增長。 已知大多數微生物生長的最佳pH范圍為7.0 (6.6-7.5)附近，部分則低于4.0。