表觀遺傳學與缺血性卒中后氧化應激的相關性研究進展

王譽博，李子孝，3，4，王擁軍，3，4

在我國，卒中是居民死亡和成人致殘的首位病因，其中缺血性卒中患者比例超過80%，70%～80%的患者因功能殘疾不能獨立生活，為我國的經濟帶來了沉重負擔[1]。在缺血性卒中帶來的患者、家庭及社會的負擔日益加重的背景下，現有的靜脈溶栓及血管內取栓等治療方法，都無法徹底修復卒中帶來的神經功能損傷。缺血性卒中后神經功能缺損大多認為與局部腦血流量的顯著減少導致氧氣和營養物質的缺乏并導致細胞死亡相關，目前許多研究表明氧化應激在其中發揮了重要作用[2]。

氧化應激是指體內氧化與抗氧化作用失衡的一種狀態，被認為是導致衰老和疾病的一個重要因素。缺血性卒中后，在腦缺血/再灌注過程中會產生大量的氧自由基（氧化劑），引起氧化應激，導致氧化性神經元死亡，尤其是線粒體功能障礙等[3]。因此，抑制氧化應激可能成為缺血性卒中治療的新方向。

表觀遺傳學是研究基因的核苷酸序列不發生改變的情況下基因表達的可遺傳變化，這些變化包含不同的基因表達模式[4]。表觀遺傳過程利用廣泛的機制促進染色質狀態的形成和維持，主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA等[4-7]。除此之外，表觀遺傳過程的特殊在于其是可逆的，其染色質的狀態是動態的，會根據局部環境的變化做出反應[4]。綜上，了解表觀遺傳調控如何影響血管神經單元中的氧化應激，對尋找缺血性卒中的特異性治療靶點具有重要意義。

1 DNA甲基化與缺血性卒中后氧化應激

DNA甲基化主要是指CpG島胞嘧啶上第5位碳原子的甲基化過程，通常能夠在不改變DNA序列的前提下，通過轉錄抑制來調節全局和特異性基因表達，是最早被發現和研究最廣泛的表觀遺傳調控機制之一[8]。在一項利用表觀基因組全關聯研究方法（epigenome-wide association studies，EWAS）評估DNA甲基化與缺血性卒中關系的研究中，研究者使用Infinium 450K和EPIC BeadChip在一個隊列（252例缺血性卒中患者和43位正常者）中評估了差異甲基化位置（differentially methylated positions，DMPs）和差異甲基化區域（differentially methylated regions，DMRs），在另一個隊列（618例缺血性卒中患者和243位正常者）中評估了重復的DMPs和卒中亞型之間的關系，使用EpiDISH在相關CpG位點上分析了差異甲基化細胞類型（differentially methylated cell-type，DMCT），最終，使用孟德爾隨機化方法對相關CpG位點進行了通路富集分析和因果關系分析，結果發現：所有重復的DMPs都與心源性、動脈粥樣硬化血栓形成和不明原因的卒中風險增加相關；DMCT分析表明，自然殺傷細胞在其中發揮了重要作用；通路富集分析顯示氧化應激等特定途徑基因過表達[9]。

DNA甲基轉移酶（DNA methyltransferases，DNMT）是介導DNA甲基化的重要因素，包括DNMT3A和DNMT3B（從頭甲基化）以及DNMT1（維持甲基化）[10]。缺血性卒中后導致機體氧化應激水平升高，產生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）/活性氮（reactive nitrogen species，RNS），ROS/RNS可直接對胞嘧啶進行化學修飾，將5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5-mC）氧化為5-羥甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5-hmC），抑制DNMT1和甲基化CpG結合蛋白（methyl-CpG binding proteins，MBP）結合到DNA，改變甲基化模式[11]。此外，過氧化物還會引起核堿基修飾，如5-氯胞嘧啶可模擬5-mC并在CpG序列中誘導不正確的DNMT1甲基化，導致基因沉默。這些研究均證明缺血性卒中后氧化應激和表觀遺傳調控之間存在聯系[12-13]。

Hcy代謝對于DNA甲基化至關重要，是表觀遺傳調控機制中的關鍵途徑。Hcy水平升高已被認為是缺血性卒中的危險因素[14-15]。Hcy代謝受損常引起血漿中Hcy濃度升高（高同型半胱氨酸血癥），導致氧化還原失衡和氧化應激增加[16]，誘發動脈粥樣硬化斑塊形成，進而引發各種心腦血管事件，主要包括缺血性心臟病和缺血性卒中[17]。

除此之外，缺血性卒中后氧化應激會導致神經細胞整體DNA甲基化水平升高，而DNMT抑制劑可以減輕缺血后氧化應激引起的神經損傷[18]。例如，5-Aza-脫氧胞苷（5-Azadeoxycytidine，5-Aza-dC）通過抑制DNA甲基化縮小了大腦中動脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型小鼠的腦梗死體積，具有神經保護作用，這可能與缺血后神經細胞功能恢復有關，但其中的具體機制仍不明確[19]。同時，也有研究者有不同的發現：在一項關于血液DNA甲基化和缺血性卒中的研究中，研究者發現缺血性卒中患者普遍存在血液長散布核元件-1（long interspersed nuclear elements-1，LINE-1）的低甲基化，同時縱向分析顯示，LINE-1甲基化水平較低的人發生缺血性心臟病和缺血性卒中的風險較高且總死亡率較高[20]。

綜上所述，DNA甲基化和缺血性卒中后氧化應激存在顯著的聯系，但其中所涉及的具體表觀遺傳機制仍有待更深入的研究。

2 組蛋白修飾和缺血性卒中后氧化應激

越來越多的研究表明組蛋白修飾在心腦血管發育、骨骼形成等多種生物學過程中扮演著重要的角色，尤其在調控神經細胞的生命周期中具有重要地位[21-22]。細胞內組蛋白包裹DNA形成核小體，多種組蛋白修飾酶可改變DNA構象，導致核小體重新定位，進而激活或抑制轉錄。組蛋白修飾包括乙酰化/去乙酰化、甲基化/去甲基化和磷酸化等。研究者發現組蛋白修飾酶的調節在缺血性卒中中有重要作用。

2.1 組蛋白乙酰化/去乙酰化 組蛋白乙酰化/去乙酰化是一個重要的翻譯后修飾，其所引起的染色質結構重塑是表觀遺傳調控的重要機制[23]。組蛋白乙酰化/去乙酰化與轉錄激活/抑制有關，并分別被兩個作用相反的酶調控，即組蛋白乙酰轉移酶（histone acetyltransferase，HATs）和組蛋白去乙酰酶（histone deacetyltransferase，HDACs）[24]。動物實驗證明HDACs在缺血性卒中過程中發揮作用，多種HDACs的表達水平隨著時間的推移而發生不同的改變：急性腦缺血后HDAC1和HDAC2表達水平呈時間依賴性下降；HDAC5的表達水平在再灌注3 h后呈時間依賴性下降；HDAC6和HDAC11的表達水平在再灌注3 h內升高，但隨著時間的推移，其表達水平也開始下降[25-26]。一項針對缺血性卒中及其亞型的歐洲人群全基因組關聯研究（genome-wide association study，GWAS）發現，編碼HDACs蛋白的HDAC9基因變異可導致卒中發生風險顯著升高[27]。

過氧化物酶是神經保護性抗氧化酶，可保護神經元免受卒中后氧化應激失衡造成的損傷。然而，其活性位點半胱氨酸在卒中后因過氧化而失活，失去對神經元的保護作用。神經突觸活性（synaptic activity）可以促進神經元中過度氧化的過氧化物酶（hyperoxidized peroxiredoxins）減少，并誘導硫氧還蛋白（Srxn1）和sestrin 2蛋白（Sesn2）的表達。研究顯示sestrin 2蛋白啟動子通過活性依賴性組蛋白乙酰化激活轉錄。通過用組蛋白去乙酰化酶抑制劑曲古抑菌素A（trichostatin A，TSA）處理神經元增強組蛋白乙酰化，可以誘導sestrin 2蛋白和硫氧還蛋白的表達[28]。同時，保護劑量的TSA可減少因氧化應激而損傷的神經元中過氧化的過氧化物酶的生成[28]。

除此之外，在小鼠缺血性卒中模型中發現，缺血再灌注3 h，HDAC3、HDAC6和HDAC11的表達顯著增加，而使用短發夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）選擇性抑制HDAC3或HDAC6，顯著改善了氧化應激后皮質神經元的存活情況，提示缺血性卒中后干預特定HDAC亞型表達可能成為新的治療方法[26]。研究者在體外細胞實驗中發現，神經元細胞和膠質細胞在氧-葡萄糖剝奪（oxygen-glucose deprivation，OGD）60 min后，HDAC1、HDAC2、HDAC3表達水平上調，其中HDAC3表達水平上調幅度最大[29]。也有研究表明HDAC4和HDAC5表達水平在腦缺血/再灌注損傷和OGD模型中均顯著降低，NADPH氧化酶介導的HDAC4和HDAC5表達通過高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein 1，HMGB1）信號通路導致腦缺血損傷，因此抑制NADPH氧化酶活性可改善腦缺血/再灌注損傷[30]。這些都表明了HDAC的不同亞型在卒中后氧化應激中發揮不同的作用并參與卒中后氧化應激的進程。

研究者在缺血性卒中小鼠實驗模型中發現泛HDAC抑制不僅保護神經元免受氧化應激，并通過促進熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）等神經保護因子的表達增加起到一定的治療作用[31]。但HDAC抑制劑對多種中樞神經細胞的毒性，阻礙了其在神經系統疾病治療中的應用。最近有研究表明，神經元損傷導致HDAC6表達增加，而抑制HDAC6則可以促進神經元的存活和再生，選擇性抑制HDAC6避免了與泛HDAC抑制相關的細胞死亡[32]。因此，HDAC6可能成為一種潛在的無毒治療靶點，用于改善以氧化應激誘導的神經變性和軸突再生不足為特征的包括缺血性卒中在內的中樞神經系統損傷[32]。

綜上所述，雖然已有部分研究證明了組蛋白乙酰化/去乙酰化與缺血性卒中后氧化應激的關系，但其特定亞型和具體機制仍不清楚，闡明特定HDAC在大腦中的作用以及開發特異性的治療策略治療卒中可能會帶來更有益的結局。

2.2 組蛋白的其他修飾 除了組蛋白乙酰化/去乙酰化，組蛋白修飾還包括組蛋白甲基化/去甲基化、組蛋白磷酸化和組蛋白泛素化等。同組蛋白乙酰化/去乙酰化一樣，其他組蛋白修飾方式在卒中后氧化應激中的作用機制也未明確。

隨著組蛋白去甲基化酶（histone demethylase，HDM）的發現，人們對組蛋白甲基化的了解也變得更多[33]。盡管已經發現了越來越多的組蛋白甲基化酶（histone methylase，HMT）和HDM，但組蛋白甲基化在卒中后的作用仍然不明。在一項動物實驗中，研究者發現與年輕雌性小鼠相比，年老雌性小鼠星形膠質細胞的組蛋白3的四位賴氨酸（histone H3 at lysine 4，H3K4）甲基轉移酶活性降低，缺血性梗死體積增大[34]。通過染色質免疫共沉淀技術（chromatin immunoprecipitation，ChIP-seq），研究者發現與年老雌性小鼠相比，年輕雌性小鼠在轉錄起始位點的組蛋白第三亞基四號賴氨酸的三甲基化（trimethylation of lysine 4 on histone H3 protein subunit，H3K4me3，轉錄增強子）富集的峰增多，而組蛋白第三亞基九號賴氨酸的三甲基化（trimethylation of lysine 9 on histone H3 protein subunit，H3K9me3，轉錄抑制子）富集的峰減少，表明缺血后年老雌性小鼠星形膠質細胞中染色質活性較低[34]。通過H3K4me3富集基因的DAVID聚類分析，研究者將250個基因富集在7個簇中，基因富集最多的簇基因本體論（gene ontology，GO）分析注釋結果為“細胞運動”，其他簇為“細胞繁殖、細胞凋亡調節、DNA損傷、離子結合、轉錄調節和磷酸化調節”，同時，京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析發現，血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達上調，VEGF是一種血管生成因子，可誘導內皮細胞增殖、抑制細胞凋亡并促進細胞遷移，在腦缺血后神經發生、細胞保護和恢復中起著重要作用[34]。這些數據表明隨著年齡的增長，星形膠質細胞的染色質活性降低，加強了對衰老相關卒中嚴重程度差異的可能機制的見解。賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1（lysine-specific demethylase 1，LSD1）是一種染色質修飾酶，可特異性去除H3K4上的甲基并誘導轉錄抑制，這是表觀遺傳轉錄激活的特定標簽之一。研究表明腦缺血再灌注損傷后，LSD1的表達在時間和空間上發生變化，表明LSD1可能參與卒中后的神經再生[35]。同時，LSD1是一種黃素依賴性胺氧化酶，其可以刺激雄激素受體依賴性轉錄，將氧氣轉化為過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）[36]。因此，LSD1參與氧化反應，其在卒中后氧化應激調節中的作用值得更深入的研究。

除了組蛋白甲基化和乙酰化外，在腦缺血后也會發生組蛋白磷酸化。研究表明離子型谷氨酸受體的過度激活會增強氧化應激，導致缺血和癲癇等神經損傷后的神經元死亡，而組蛋白翻譯后修飾可能是檢測和修復氧化應激損傷（包括DNA損傷）的關鍵方式，因此可能會影響以過度釋放谷氨酸為特征的損傷后的神經元存活[37]。缺血后過度活躍的谷氨酸受體增加了氧化應激并誘發了神經元中的磷酸化組蛋白H2AX（γ-H2AX）增多，γ-H2AX隨著卒中進展而積累，但這種情況可以通過抗氧化劑預處理得到改善[37]。IκB激酶（inhibitor of kappa B kinase，IKK）復合物是核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路經典激活的核心成分，研究發現在銅/鋅超氧化物歧化酶（Cu/Zn-superoxide dismutase，SOD1）敲除小鼠中，短暫性局灶性腦缺血后，NF-κB誘導激酶（NF-κB inducing kinase，NIK）（IKKα的上游激酶）、磷酸化IKKα（phosphorylation of IKKα，pIKKα）和磷酸化組蛋白H3（phosphorylation of histone H3，pH3）（Ser10）水平增加[38]。進一步研究發現，OGD誘導氧化應激后小鼠腦內皮細胞中pH3增強，導致細胞死亡。用IKKα小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）治療可顯著減少 OGD后的細胞死亡。這些結果表明，氧化應激相關的NIK、IKKα和pH3的增加與腦缺血后的細胞死亡有關[38]。

綜上所述，不同類型的組蛋白修飾在缺血性卒中后氧化應激中都發揮著重要但不確切的作用，需要進一步闡明。

3 非編碼RNA與缺血性卒中后氧化應激

功能性非編碼RNA在基因表達中發揮著重要作用，可分為長鏈非編碼RNA和短鏈非編碼RNA，其中，短鏈非編碼RNA中的微小RNA（microRNA，miRNA/miR）與多種卒中危險因素有關，包括動脈粥樣硬化和高血壓等[39-40]。miRNA是大約22個核苷酸的小RNA分子，在基因組水平對基因表達進行調控，主要表現為轉錄后負調控。研究表明，miR-424可縮小缺血/再灌注后的梗死體積并抑制神經元凋亡，降低皮質中的ROS和丙二醛水平，總體來說miR-424通過抑制氧化應激來預防短暫性腦缺血/再灌注損傷[41]。miR-210是一種受缺氧誘導因子和Akt激酶依賴性途徑調節的重要miRNA，研究表明其表達增加與迷走神經刺激調節腦缺血/再灌注的氧化還原狀態有關，是針對腦缺血/再灌注損傷神經保護的潛在靶點[42]。在小鼠中，miR-137通過抑制Src依賴性MAPK信號通路減弱氧化應激、凋亡和炎癥通路，從而對缺血性卒中產生神經保護作用[43]。腦組織中最豐富的miRNA為miR-124，研究表明miR-124在腦缺血后的外周血和腦血管內皮細胞中表達上調，實驗證實miR-124可通過激活PI3K/AKT/Nrf2通路增加熱休克蛋白表達，從而抑制氧化應激和細胞凋亡來保護小鼠嗜鉻細胞瘤細胞株（pheochromocytoma-12，PC-12）免受糖氧剝奪離體腦缺血/再灌注誘導的損傷[44]。

miRNA在缺血性卒中病理生理機制中的作用成為近年來的研究熱點之一，除去單純的機制研究，未來利用miRNA進行靶向治療也可能成為新的探索方向。

缺血性卒中后腦損傷包括卒中后炎癥反應、氧化應激、線粒體功能紊亂、血腦屏障破壞等導致的細胞死亡和神經功能缺損等。近年來，氧化應激反應在缺血性卒中后腦損傷中的作用越來越受到人們的關注。大量研究證實卒中后氧化應激與表觀遺傳機制之間存在緊密聯系，但其中的機制是復雜且不清的，需要更深入的研究探索表觀遺傳機制在卒中后氧化應激中的具體作用。基于此，未來通過干預表觀遺傳調控，改善卒中后氧化應激失衡帶來的腦損傷，可能成為缺血性卒中治療的新方向。