miR-140-5p通過調節自噬影響結直腸癌細胞對奧沙利鉑的敏感性

延飛飛 李宏武

中國醫科大學附屬第四醫院普外科（沈陽110032）

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球第三大癌癥致死的主要原因之一［1］。奧沙利鉑是治療CRC 最常用的藥物之一［2］。通過誘導鏈內加合物的形成，奧沙利鉑可以抑制細胞周期的進展，促進增殖細胞的死亡［3］。然而，新生和獲得性奧沙利鉑耐藥顯著降低了該藥物治療CRC 的療效［4］。因此，深入研究CRC 耐藥的分子機制，提高臨床治療效果具有重要意義。

微小核糖核酸（microRNAs，miRNAs）是小的、非編碼的單鏈RNA 分子［5］。據報道，miRNAs 的失調有助于多種癌癥的發生，包括CRC［6］。CRC 患者血漿外泌體中miR-23b的表達水平較正常健康人明顯降低，其低表達與腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移、TNM 分期、脈管浸潤、神經侵犯顯著相關［7］。此外，許多miRNA 已經被確定通過調控靶基因參與CRC 的化療耐藥［8］。先前的研究表明CRC患者血清miR-140-5p較對照組明顯下調，并與TNM 分期和淋巴結轉移等臨床病理參數顯著相關［9］。KOUSTAS 等［10］研究表明miR-140-5p 的下調與CRC 的晚期和較低的總生存率顯著相關。miR-140-5p通過抑制細胞增殖、遷移和侵襲而起到抑癌作用。因此，miR-140-5p可能在CRC中起到抑癌作用，以作為一種新的預后標志物和治療靶點。然而，miR-140-5p在CRC耐藥中的研究鮮有報道。

細胞自噬通過降解細胞器來使其適應缺氧或營養缺乏等腫瘤微環境，研究表明自噬在CRC 的進展中起著至關重要的作用［11］。因此，探討CRC中自噬調節機制對于新型治療是必不可少。當前研究表明自噬在參與CRC 細胞耐藥中發揮重要作用［12］。已有研究發現，多個miRNA在CRC自噬的調節中起著重要作用，這種調節可以影響腫瘤的進展。miR-140-5p 在CRC 干細胞中的異位表達導致自噬破壞，抑制腫瘤干細胞生長和球形形成［13］。但是目前關于miR-140-5p 調控自噬在CRC 細胞奧沙利鉑耐藥中的相關作用尚未明確。

本文旨在研究miR-140-5p 對CRC 細胞奧沙利鉑的敏感性，并探索miR-140-5p 是否通過調節自噬促進CRC 細胞奧沙利鉑敏感性的影響，為臨床診治提供一定的策略。

1 材料與方法

1.1 組織來源和細胞培養收集中國醫科大學附屬第四醫院2018年12月至2019年12月之間手術切除的30 例CRC 組織標本。本研究取得醫院倫理委員會批準，并經患者簽署知情同意書后進行。3種人CRC細胞系（HT-29，RKO，HCT-116）和1種人回盲腸腺癌細胞系（HCT-8）及正常結直腸上皮細胞FHC 均購置于中國生命科學院上海細胞研究所（中國，上海）。細胞培養用RPMI-1640 添加10%胎牛血清（Hyclone 公司，美國），在5%CO2、37 ℃培養箱中常規培養。

1.2 RNA 提取及qPCR 檢測使用Trizol 試劑（Invitrogen 公司，美國）用于裂解細胞并收集RNA，后加入1/5 體積氯仿離心，取上清加入等體積異丙醇過夜。使用Power SYBR Green（TaKaRa 公司，大連）做real-Time PCR 分析。miR-140-5p 上游引物：5′-TCATGATGGAATTGGAGCCTT-3′，下游引物：5′-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3′；β-Actin 上游引物：5′-TCAAGATCATTGCTCCTCCTG-3′，下游引物：5′-CTG-CTTGCTGATCCACATCTG-3′。實時PCR 和數據收集基于ABI 7500 平臺。miR-140-5p 相對于β-Actin 的表達采用2-ΔΔCt法計算并標準化。

1.3 質粒的構建及細胞轉染miR-140-5p 過表達質粒購自上海吉凱基因公司，選用miR-NC 空白載體作為陰性對照。將CRC 細胞株HCT 116 按每孔5 × 105個種于6 孔板中，待細胞達到80%融合時，用miR-140-5p mimics 以及相應的陰性對照miR-NC 通過Lipofectamine 3000（Invitrogen 公司，上海）轉染細胞，48 h 后收獲細胞用于RT-qPCR 檢測，72 h 后用于western blot 檢測。

1.4 CCK-8 法測定細胞增殖能力取對數生長期細胞接種于96 孔板中（5 × 103個/孔），各組細胞經相應處理后繼續培養24 h，分別加入10%CCK-8培養基，置于培養箱中孵育2 h。最后，用酶標儀測定450 nm 波長下各樣本的OD值。

1.5 Western blot 法檢測蛋白表達收集不同處理因素下的細胞，用預冷卻的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）液將其沖洗兩次。然后快速加入細胞裂解緩沖液以使細胞裂解。收集蛋白質后，用標準曲線法檢測蛋白質濃度，定完蛋白濃度后各樣品加入5×上樣緩沖液煮沸5 min。配好膠后加入相同量的蛋白質，之后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。隨后，在50 V 恒定電壓的情況下轉膜120 min，將蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，然后用5%干燥的脫脂乳密封PVDF 膜2 h，用特定抗體孵育一抗、二抗，進而檢測特定蛋白（LC3、β-actin 抗體購置于Cell Signaling Technology 公司）的表達，β-Actin 作為對照。

1.6 免疫熒光實驗檢測自噬小體將爬片放入6 孔板中，將穩定表達的HCT 116 細胞接種于6 孔板中，待細胞貼壁且生長到80%左右，分別轉染miR-140-5p mimics 以及miR-NC，于培養箱培養24 h 之后每孔加入預冷的4%多聚甲醛1 mL 室溫固定20 min，漂洗三次后每孔加入0.5% TritonX-100 室溫下孵育10 min。漂洗三次后加入2%BSA 室溫下封閉30 min。之后加入LC3 一抗，孵育過夜后避光加入熒光二抗（綠色標記），滴加DAPI 復染核（藍色標記）。以miR-NC作為陰性對照，在熒光顯微鏡下檢測各組CRC細胞內LC3熒光斑點的分布與數量。

1.7 克隆形成實驗取對數生長的CRC 細胞，用0.25%胰蛋白消化并吹打成單個細胞，把細胞懸浮在10%胎牛血清的RPMI-1640 培養液中備用。以每孔100 個細胞密度接種6 孔板中，待24 h 細胞貼壁后分別給予不同的處理方式，置37 ℃、5% CO2的濕潤的環境下培養1 ～2 周，經常觀察，當在顯微鏡下出現團狀克隆時，終止培養，棄去上清，用PBS 小心浸洗2 次，每孔加入4%多聚甲醛固定15 min，之后用結晶紫染色10 min，然后用流水緩慢洗去染色液，干燥后進行圖片采集。

1.8 統計分析SPSS 軟件（SPSS 22.0）用于進行結果統計。Image J 進行蛋白和熒光定量分析，GraphPad Prism7.0 和Photoshop 和用于圖像處理。實驗數據定量資料以均數±標準差表示，選用獨立樣本t檢驗進行統計學分析。P＜0.05 則認為差異有統計學意義。

2.2 過表達miR-140-5p促進CRC細胞對奧沙利鉑的敏感性為檢測過表達miR-140-5p對CRC細胞對奧沙利鉑的敏感性，用miR-NC和miR-140-5p mimics質粒轉染CRC細胞系HCT-116，構建miR-140-5p過表達細胞。RT-qPCR 用于分析miR-140-5p 表達。miR-NC 的表達標準化為1，miR-140-5p mimics轉染組的miR-140-5p 相對高表達（P=0.000 2，圖2A）。之后利用CCK-8 實驗檢測miR-NC 和miR-140-5p mimics 轉染組在不同濃度奧沙利鉑處理24 h 下的細胞增殖情況。結果顯示，在5 μmol/mL［（78.767±3.365）vs.（60.800±4.300）］、10 μmol/mL［（63.900±4.011）vs.（37.600 ± 5.251）］、15 μmol/mL［（52.433±6.104）vs.（28.567±2.909）］、20 μmol/mL［（50.800±3.351）vs.（21.200±4.518）］濃度的奧沙利鉑處理24 h 下，過表達miR-140-5p 促進CRC 細胞系HCT-116對奧沙利鉑的敏感性（P＜0.000 1,圖2B）。

圖2 不同濃度奧沙利鉑處理下，過表達miR-140-5p 對結腸癌細胞活性的影響Fig.2 Effect of overexpression of miR-140-5p on the cell viability of CRC cells treated with different concentrations of oxaliplatin

2 結果

2.1 miR-140-5p 在CRC 組織中及細胞系中的表達RT-qPCR 用于檢測30 例CRC 組織及相應癌旁組織樣本中miR-140-5p 表達，癌旁組織表達標準化為1，CRC 組織中的miR-140-5p 的平均表達水平低于癌旁組織（0.343±0.107），差異有統計學意義（P=0.0015，圖1A）。RT-qPCR 用于分析細胞中miR-140-5p 的表達，正常結腸上皮細胞（FHC）的表達標準化為1，結果表明在HCT-8、HT-29、RKO、HCT-116 中miR-140-5p 的表達低于FHC 細胞，其中HCT-116 細胞系差異有統計學意義（P＜0.05），用于后續實驗（圖1B）。

圖1 miR-140-5p 在CRC 組織中及細胞系中的表達Fig.1 Expression of miR-140-5p in CRC tissues and cell lines

2.3 過表達miR-140-5p 抑制CRC 細胞的自噬由于自噬在CRC 的發生發展中起到關鍵的調控因素，檢測miR-140-5p 是否能調節CRC 細胞的自噬。Western blot 檢測LC3 蛋白的表達，與miR-NC相比，轉染miR-140-5p mimics 后LC3 II/I 表達水平相對降低（P=0.008，圖3A、B）。為進一步證實miR-140-5p 對自噬水平的影響，免疫熒光進行檢測與western blot 結果一致，miR-140-5p 過表達組LC3 熒光表達減弱（圖3C）。綜上，過表達miR-140-5p 抑制CRC 細胞自噬的表達水平。

圖3 過表達miR-140-5p 對CRC 細胞自噬的影響Fig.3 Effect of overexpression of miR-140-5p on autophagy of CRC cells

2.4 過表達miR-140-5p 合并雷帕霉素減弱CRC細胞對奧沙利鉑的敏感性為驗證miR-140-5p 是否通過自噬對奧沙利鉑的敏感性產生作用，轉染miR-140-5p mimics 并使用自噬激活劑雷帕霉素（rapamycin，Rapa）共同處理，免疫熒光檢測發現，與過表達miR-140-5p相比，過表達miR-140-5p并處理Rapa 組的LC3 熒光表達增強（圖4A）。CCK-8 結果表明在不同濃度的奧沙利鉑處理下，miR-140-5p 加Rapa 組能夠逆轉miR-140-5p 組導致的增殖減少情況（P= 0.001 9, 圖4B）。此外，選取在奧沙利鉑10 μmol/L 進行克隆形成實驗，發現與對照組相比，奧沙利鉑處理下細胞克隆水平降低（P＜0.000 1）；過表達miR-140-5p加Rapa組的細胞菌落相比過表達miR-140-5p 組更多（P= 0.003 9，圖4C）。以上結果表明，miR-140-5p 能調控自噬從而影響CRC 細胞對奧沙利鉑的敏感性。

圖4 過表達miR-140-5p 并促進自噬后，CRC 細胞對奧沙利鉑的敏感性Fig.4 Sensitivity of CRC cells to oxaliplatin after overexpression of miR-140-5p and promotion of autophagy

3 討論

在癌癥治療中，治療耐藥性是一個重大的挑戰。奧沙利鉑耐藥是目前CRC 化療的主要障礙之一。盡管腫瘤治療取得了很大進展，但由于化療耐藥機制的復雜性，大多數臨床有效的化療誘導劑都是無效的［1］。

近年來，miRNA 的異常表達與CRC 化療耐藥的發生有關［12］。miR-302a 在西妥昔單抗耐藥的CRC 細胞中的表達降低，過表達miR-302a 在功能上抑制了CRC 細胞的遷移、侵襲和轉移，且miR-302a 的高表達恢復了CRC 細胞對野生型KRAS 和BRAF 基因的化療反應性［13］。miR-140-5p 是被認為在CRC 的發展中起到抑癌的作用，其可通過直接靶向SOX4 抑制結直腸癌細胞增殖和侵襲［14］。此外，miR-140-5p 可抑制CRC 的進展和轉移［15］。但miR-140-5p 調控CRC 耐藥的分子機制尚未有研究報道。本研究結果表明，在CRC細胞中miR-140-5p 呈現低表達狀態，而過表達miR-140-5p 后促進了CRC 細胞奧沙利鉑的敏感性，本研究結果與前所述一致，這說明miR-140-5p 在CRC 中主要發揮抑癌的作用。然而miR-140-5p對CRC化療藥物敏感性的研究目前國內外尚無報道，本研究表明miR-140-5p 可以促進CRC 細胞對奧沙利鉑的敏感性。

越來越多的文獻表明，自噬可能有助于癌癥發展。自噬激活可促進癌細胞存活（保護性自噬）或導致癌細胞死亡（細胞毒性/非保護性自噬）［16-17］。有研究表明阿帕替尼治療CRC 細胞時可以誘導保護性自噬，而阿帕替尼與自噬抑制劑氯喹聯合應用在體外和體內均具有最顯著的抗腫瘤作用［18］。miR-489在大多數乳腺癌細胞和多個耐藥的乳腺癌細胞中均處于下調狀態，其可以通過抑制自噬來促進乳腺癌細胞對阿霉素的敏感性［19］。而miR-140-5p 在CRC 中的調控自噬的分子機制尚不清楚。本研究表明過表達miR-140-5p 可以抑制CRC 細胞的自噬并提高對奧沙利鉑的敏感性，而過表達miR-140-5p 并使用自噬激活劑雷帕霉素時卻降低了對奧沙利鉑的敏感性，那么miR-140-5p參與調控CRC細胞自噬的哪個階段，還有待進一步的探究。

綜上所述，miR-140-5p 在CRC 細胞中低表達，其過表達通過抑制自噬促進了CRC 細胞對奧沙利鉑的敏感性，不僅為CRC的臨床診治提供了有力的理論基礎，還為CRC的靶向治療提供了潛在的分子靶點。