HIV-1感染者外周血T細胞miR-155水平與免疫激活和耗竭的關系研究

趙增艷 韋彩雯 張源 程林芳 靳昌忠

上海交通大學醫學院附屬新華醫院崇明分院1全科醫學科，2神經內科（上海202150）；3浙江大學醫學院附屬第一醫院傳染病診治國家重點實驗室（杭州310003）

HIV-1 感染者進展到艾滋病階段的一個重要特征是存在廣泛的非特異T 細胞慢性免疫激活，并能夠被抗病毒治療在一定程度上抑制［1-2］。許多T細胞免疫激活分子的表達與HIV-1感染密切相關，如CD38 和HLA-DR 等T 細胞激活標記［3-4］。由于HIV-1 難以清除并以低水平持續存在，長期刺激T 細胞激活進而導致其增殖和應答能力的缺失，即免疫耗竭［5-7］。miRNA 是細胞內一類沒有編碼能力的RNA，在免疫細胞發育和免疫功能調控中有重要作用［8-10］。miR-155 近年來被發現是T 細胞功能分化的重要調控因子，可以調控CD4+T 細胞分化為不同的功能亞群，參與CD8+T 細胞的激活過程［9-10］。此外，miR-155 與HIV-1 感染密切相關。有研究發現，HIV-1 感染者血漿中的miR-155水平與HIV-1 疾病進展程度有關，長期不進展者顯著較低［11-13］。此外，miR-155 還可以通過其它機制來抑制HIV-1 的感染，例如降低HIV-1 感染所需的宿主蛋白的表達水平等［14-15］。目前對于miR-155 在HIV-1 感染者T 細胞免疫應答中的作用尚未明確，已有研究多是體外研究，基于HIV-1 感染者隊列的體內研究較少。鑒于T 細胞免疫狀態對HIV-1 感染的重要性以及miR-155 在T 細胞功能調控中的重要作用，本文重點研究HIV-1 感染者miR-155 與T 細胞免疫激活和耗竭的關系，為臨床免疫狀況評估提供重要的參考指標。

1 材料與方法

1.1 一般資料147 例HIV-1 感染者來自門診確診患者，抗病毒治療1年以上，選取58 例體檢者納入健康對照組。排除合并其它感染、血液或免疫性疾病者，以及近期使用免疫抑制劑或其它對T 細胞功能有影響的藥物的患者。HIV-1 感染者根據《中國艾滋病診療指南（2018 版）》［16］按照免疫學療效分為治療有效組（71 例）和治療無效組（76 例）。所有參與者均知情同意，研究方案通過浙江大學醫學院附屬第一醫院倫理委員會審核。

1.2 miR-155檢測抽取患者5 mL抗凝血，分離外周血單個核細胞并用免疫磁珠（德國美天旎公司）分選CD4+和CD8+T細胞后，使用Qiagen RNeasy Micro Kit 試劑盒（德國凱杰公司）提取細胞總RNA。使用Takara 熒光定量PCR 試劑（大連寶生物公司）和人miR-155 特異性引物（廣州銳博公司）進行一步法定量PCR 檢測T 細胞內miR-155 水平，內參為U6 RNA，根據CT 值計算miR-155 相對表達水平。

1.3 流式細胞術使用美國BD 公司FACScanto Ⅱ流式細胞儀，抗人CD3-PE-Cy7、抗人CD38-FITC、抗人CD4-PE、抗人CD8-APC 和抗人PD-1-FITC 抗體購自BD 公司，抗體組合方案如下：CD3+CD4+CD8+CD38+和CD3+CD4+CD8+PD-1。每管取50 μL全血與抗體室溫避光孵育15 min 后裂解紅細胞，上機檢測。

1.4 HIV-1 RNA 定量檢測HIV-1 病毒載量檢測使用羅氏cobas AmpliPrep/cobas TaqMan 病毒載量檢測系統（瑞士羅氏公司）進行，檢測下限為20 copies/mL。

1.5 統計學方法采用SPSS 20.0 軟件，組間比較采用t或χ2檢驗，三組間比較采用單因素方差分析，相關分析采用Pearson 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況比較治療有效組CD4+T 細胞為（584.87 ± 242.43）/μL，高于治療無效組（374.89 ±193.46）/μL（P＜0.01），CD8+T 細胞治療有效組（548.23 ± 331.45）/μL 低于治療無效組（865.38 ±213.56）/μL，（P＜0.01）。見表1。

表1 HIV-1 感染者及健康對照組臨床信息和實驗室指標比較Tab.1 Comparison of clinical information and laboratory indexes between HIV-1 infected subjects and healthy controls x±s

2.2 外周血miR-155 水平比較治療無效組CD4+和CD8+T 細胞miR-155 水平分別為（47.53±11.30）和（67.98 ± 22.73），顯著高于治療有效組［（23.87 ±6.54）vs.（34.69 ± 12.78）］和健康對照組［（12.76 ±5.35）vs.（17.87±9.65）］（均P＜0.05）。見表1。

2.3 T 細胞免疫激活和耗竭水平比較治療無效組CD4+和CD8+T 細胞免疫激活水平（CD38+%）最高，分別為（43.88±14.92）%和（56.93±15.79）%，治療有效組分別為（27.42±8.65）%和（38.87±9.13）%，高于健康對照組（P＜0.01）。見表1。

治療無效組T 細胞免疫耗竭水平（PD-1+%）最高，分別為（37.82 ± 16.48）%和（44.68 ± 20.37）%，治療有效組T 細胞免疫耗竭水平亦高于健康對照組，除治療有效組CD4+PD-1+%與健康對照之間差異外，其余差異均有統計學意義（P＜0.01）。見表1。

2.4 外周血T 細胞miR-155 水平與免疫激活和耗竭指標的相關性分析HIV-1 感染者T 細胞miR-155 水平與免疫激活和耗竭正相關（P＜0.05），健康對照組T 細胞miR-155 與細胞激活呈正相關（P＜0.05），與免疫耗竭相關性不顯著（P＞0.05）。見表2。

表2 外周血T 細胞miR-155 水平與免疫激活和耗竭指標的相關性分析Tab.2 Correlation analysis of miR-155 level and immune activation and exhaustion in T cells

3 討論

有效的抗病毒治療能夠對感染者的免疫功能和狀態起到一定的恢復作用［17-18］。除了CD4+T 細胞數量和比例這一經典指標外，T 細胞免疫激活、耗竭等指標及其調控因素對判斷HIV-1 感染者免疫狀態有重要的臨床價值［19-20］。本文通過對抗病毒治療有效和無效的HIV-1 感染者以及健康對照進行橫斷面觀察研究發現，HIV-1 感染者T 細胞miR-155 表達、免疫激活和耗竭水平均顯著升高，以治療無效者更顯著，miR-155 與免疫激活和耗竭水平正相關。這表明HIV-1 感染能提高T 細胞miR-155 表達，并影響T 細胞激活和耗竭水平，有效的抗病毒治療可以部分逆轉這一改變。但研究未發現miR-155 與HIV-1 載量存在直接相關性。

miR-155 可以通過多種機制影響HIV-1 感染。有研究發現HIV-1 感染者效應型調節性T 細胞miR-155表達水平高于未感染者［11-12］。miR-155能降低樹突狀細胞表面協同受體的表達以抑制HIV-1的感染能力［15］。本研究發現，miR-155 可通過調節T 細胞免疫激活和耗竭水平來影響感染的進展。持續的非特異性T 細胞免疫激活是HIV-1 感染造成T 細胞免疫功能缺陷的主要因素［21］。miR-155能夠調節CD8+T 細胞不同亞群的增殖和分化，維持記憶型和效應記憶型CD8+T 細胞的比例［22］。本研究發現miR-155 對于維持HIV-1 感染者的CD4+T 細胞的免疫激活狀態也很重要。PD-1 是一種免疫抑制性受體，與T 細胞免疫耗竭相關［7］。本研究發現HIV-1 感染者T 細胞表面PD-1 表達升高，有效的抗病毒治療能夠部分降低PD-1 的表達水平，這與既往研究一致［21］。但本研究并沒有發現T 細胞表面PD-1 表達水平與病毒載量和CD4+T 細胞數存在相關性，而是與miR-155 相關，提示miR-155可能參與了T 細胞的免疫耗竭調控。

本研究存在一定的局限性，僅對HIV-1 感染者的T 細胞免疫狀態和miR-155 水平等指標進行了橫斷面研究，僅揭示了miR-155 與T 細胞免疫激活和耗竭的相關性，未闡明三者間的因果關系和相互作用機制。許多問題還有待于通過隊列隨訪和機制研究進一步探索。如T 細胞的免疫耗竭由免疫激活導致還是由miR-155 直接調控的機制，HIV-1感染是如何改變miR-155 表達水平，以及抗病毒治療恢復miR-155 水平和T 細胞免疫功能的原理。

總之，本研究結果提示miR-155 參與了HIV-1感染者T 細胞免疫激活和耗竭的調控，抗病毒治療能夠一定程度上抑制miR-155 表達水平并部分恢復T 細胞免疫功能。檢測T 細胞miR-155 水平可為臨床評估HIV-1 感染者T 細胞功能提供重要的參考。