青蒿素對大鼠自體移植靜脈橋內膜增生的影響

黃強信 周念 馮志強 韋懿桐

廣西中醫藥大學第一附屬醫院胸心血管外科（南寧530023）

大隱靜脈仍是冠狀動脈旁路移植術（coronary artery bypass grafting，CABG）的常用血管橋［1］，然而，移植術后靜脈橋再狹窄率較高，嚴重影響手術遠期療效［2］。術后大隱靜脈橋通暢率是CABG 術后成功的關鍵，術后1年靜脈橋通暢率為80% ～90%，術后10年下降至40% ～50%［3］。因此，如何改善靜脈橋的中遠期通暢性仍是目前國際研究熱點。

冠脈搭橋術后血管橋再狹窄的病理生理基礎依次是早期血小板血栓形成、中期內膜增厚以及晚期粥樣硬化征［4］。合理應用抗凝藥可防止早期血管橋狹窄，晚期避免冠心病的各類高危因素可延緩粥樣硬化征象的再次出現，然而，術后中期如何抗平滑肌細胞增殖及內膜增厚的相關研究則有所欠缺，若能找到有效抗內膜增厚的臨床方法，對抗冠脈搭橋術后中期血管橋再狹窄將具有積極的作用［5］。因此，血管橋再狹窄主要是血管平滑肌細胞（VSMCs）發生表型轉化導致增殖及遷移［6-7］。研究表明［8］平滑肌22α（SM22α）蛋白是維持VSMCs 收縮表型所必需的一種重要細胞骨架相關蛋白，也是鑒定VSMCs 表型轉化極為敏感的特異性標志物。近年研究不斷發現，青蒿素及其衍生物藥理活性廣泛，是一種從黃花蒿中提取的倍半萜內酯類過氧化物類藥物，具有安全、價格便宜、口服吸收良好等優點。對心律失常、心肌缺血、動脈粥樣硬化等心血管疾病均有良好的改善作用［9-11］。其中，青蒿素可通過抑制VSMCs 表型從收縮表型向去分化表型轉變，具有改善動脈粥樣硬化進展的藥理作用［12-13］，然而，在靜脈橋是否有影響仍是未知。本研究擬通過大鼠自體靜脈移植模型，探討其對移植后靜脈橋內膜增生的影響。

1 材料與方法

1.1 材料青蒿素（meilunbio MB6836），兔抗SM22α多克隆抗體（Abcam 公司，ab14106），山羊抗小鼠IgG-HRP、RIPA 蛋白裂解液和BCA 蛋白濃度測定試劑盒（碧云天公司）。內參β-Actin（康成生物公司），免疫組化試劑盒（博士德公司），HE 染色試劑盒（南京建成生物技術有限公司），雙目雙人顯微鏡（新天醫療器械公司）及顯微外科器械一套（寧波手術器械廠），Alpha View 成像系統（美國Protein Simple 公司）。健康雄性SD 大鼠32 只，體質量240 ～280 g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供。

1.2 動物模型的建立術前常規禁食，使用10%水合氯醛按300 mg/kg 腹腔注射麻醉，肝素鈉（200 U/kg）尾靜脈注射達肝素化。取頸部正中切口約2.5 cm，常規備皮、消毒及切開皮膚，逐層分離，暴露右頸外靜脈，8/0 結扎其屬支，離取0.8 ～1.0 cm 遠心端主干，肝素鈉鹽水沖管腔及浸泡其中備用。于右側氣管旁、胸鎖乳突肌下充分游離頸總動脈至分叉處，長約1.0 ～1.2 cm，盡量避免損傷氣管旁小動脈分支及迷走神經，罌粟堿稀釋液噴灑動脈表面。頸總動脈兩端用無損傷血管夾阻斷血流，中間離斷，切除動脈約0.5 cm，肝素鈉鹽水沖洗管腔并清除血凝塊。利用“cuff”管套管技術將切下頸外靜脈吻合于頸總動脈，建立自體靜脈移植的模型。術后當天青霉素400 KU/kg 肌肉注射，常規飼養。

1.3 動物模型分組及處理按電腦隨機數法分成青蒿素治療實驗組和對照組，各分為靜脈移植術后2 周和4 周時間點，每個時間點8 只。實驗組和對照組分別在術前1 d 至取材時間給予青蒿素100 mg/（kg·d）、等體積生理鹽水灌胃。因麻醉過量、切口感染、腸梗阻、其他原因而死亡或血管閉塞的大鼠不列入后續研究。

1.4 靜脈橋標本的采集及處理在術后2 周和4周沿原切口找到靜脈橋，充分分離并取下靜脈橋，肝素鈉鹽水沖洗干凈，一部分用4%多聚甲醛液固定，備行HE 染色與免疫組織化學檢測，另一部分保存于液氮罐備行Western bolt 檢測。

1.5 病理形態學及免疫組化染色血管橋標本用4%多聚甲醛液固定后，常規脫水、透明、浸蠟、包埋，制成蠟塊，切片用常規蘇木精-伊紅染色（HE染色），采用計算機圖像分析軟件（Image-Pro Plus 6.0）測量血管中段橫截面新生內膜厚度，每個標本隨機取5 處不連續的位置測量，計算平均厚度。石蠟切片常規脫蠟，3%過氧化氫室溫孵育5 min，微波爐抗原修復，5%～10%正常山羊血清封閉，滴加一抗兔抗SM22α 多克隆抗體（工作濃度1∶100），4 ℃冰箱過夜。滴加生物素標記二抗工作液，37 ℃孵育15 min。滴加SABC 復合物37 ℃孵育15 min。DAB 顯色，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封閉固定后行光鏡檢查，光鏡下平滑肌胞質內見淡黃至棕黃色顆粒為SM22α 陽性細胞，散在淡棕黃色為弱陽性，無棕黃色為陰性。

1.6 靜脈橋組織SM22α蛋白表達的測定取靜脈橋血管組織約5 mg，加入RIPA 蛋白裂解液60 μL和PMSF1 μL 進行總蛋白的提取，BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定樣本蛋白的濃度。蛋白于12%SDS-聚丙酰胺凝膠電泳90 min，濕法電轉50 min 轉至聚偏氟乙烯（PDVF）膜后，剪出目的條帶，6%脫脂奶封閉1.5 h，加兔抗SM22α 多克隆抗體（1∶1 000）進行抗體結合，4 ℃過夜，TBST 洗膜后加山羊抗小鼠IgG-HRP（1∶1 000）室溫下孵育1 h，TBST 洗膜后滴加ECL 發光混合液在Alpha View 成像系統中顯影。以β-Actin（1∶1 000）為內參抗體。圖像用成像系統中的Multiplex Band Analysis 軟件進行蛋白條帶的灰度值分析；以SM22α 蛋白與β-Actin 蛋白條帶的灰度積分比值來代表目的蛋白的相對表達量來分析結果。

1.7 統計學方法采用SPSS 17.0 統計軟件，實驗數據以均數±標準差表示。兩組間比較用t檢驗，多組用方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 動物模型建立及靜脈橋通暢情況32 只SD大鼠手術均成功，均符合實驗要求，術中、術后見靜脈橋充盈良好。術后2 周、4 周靜脈橋血管均不同程度的膨脹增粗及小血管增生。剪斷靜脈橋遠端動脈，可見血液噴出，證實靜脈橋通暢。

2.2 組織形態學改變HE 染色結果示，光鏡下術后2 周內皮細胞排列紊亂及平滑肌細胞增生明顯，4 周比較明顯，經青蒿素治療2 周和4 周后新生內膜與同期對照組相比：內膜相對完整，內皮細胞和平滑肌細胞明顯減少，內膜的厚度與同期相比明顯顯著減少。差異均有統計學意義（圖1 和表1）。

圖1 兩組血管內膜增厚情況（HE 染色，×200）Fig.1 Intimal hyperplasia in two groups（HE stained，×200）

表1 實驗組與對照組內膜增生厚度的比較Tab.1 Comparion of intima thickness between treatment group and control group ±s

表1 實驗組與對照組內膜增生厚度的比較Tab.1 Comparion of intima thickness between treatment group and control group ±s

注：與同期對照組新生內膜厚度比較，aP＜0.01

組別數量（只）平均內膜厚度（μm）實驗組2 周對照組2 周實驗組4 周對照組4 周8 8 8 8 20.79±1.88a 35.23±2.66 37.06±2.22a 46.23±2.54

2.3 免疫組織化學染色結果鏡下可見靜脈橋組織平滑肌細胞胞質呈棕黃色，即SM22α 蛋白表達陽性，其他區域無棕黃色或呈稀疏淡棕色，即SM22α 蛋白表達陰性或弱陽性（圖2）。結果顯示，經青蒿素治療后2 周和4 周靜脈橋組織中SM22α蛋白表達陽性率與同期對照組相比，對照組下降顯著［（59.20±5.76）vs.（26.12±3.72），P＜0.01；（35.63 ± 4.36）vs.（10.38 ± 2.98），P＜0.01］，差異均有統計學意義。

圖2 SM22α 蛋白在靜脈橋的表達變化（免疫組化，×200）Fig.2 Changes of SM22α protein expression in graft veins（Immunohistochemistry，×200）

2.4 Western blot 結果用Western blot 方法檢測移植靜脈橋組織中SM22α 蛋白表達，結果顯示，經青蒿素治療后2 周和4 周靜脈橋組織中SM22α 蛋白含量（SM22α/β-Actin）與同期對照組相比，對照組下降顯著［（0.58±0.1）vs.（0.39±0.06），P＜0.01；（0.42 ± 0.06）vs.（0.21 ± 0.05），P＜0.01］，差異均有統計學意義。見圖3。

圖3 SM22α 蛋白在靜脈橋組織的相對表達量變化情況Fig.3 The relative expression of SM22α protein in graft veins

3 討論

靜脈橋血管再狹窄的發生、發展是多因素、多因子共同參與的結果，包括早期的內皮損傷、血栓形成、再內皮化、靜脈橋血管的動脈化，中期的內膜增生以及晚期的粥樣硬化及斑塊破裂等［14-15］。研究表明［4，16］，在手術創傷、移植靜脈缺血及再灌注性損傷、靜脈血流動力學改變等諸多因素的刺激下，移植血管打破正常生長調控機制，血管壁細胞增殖與凋亡調控失衡，促進血管內膜重塑，新生內膜發生增生、增厚最終導致了再狹窄，而血管平滑肌細胞的增殖、遷移是其中的關鍵病理過程。

本實驗結果顯示，在自體靜脈移植術后2 周，實驗組和對照組均出現平滑肌細胞大量增殖并且向內膜下遷移及內皮細胞排列紊亂至新生內膜增厚，術后4 周更為顯著；但實驗組與同期對照組相比，新生內膜厚度明顯減少。這說明，實驗組靜脈橋再狹窄的程度輕。

VSMCs 在成人血管中表現為成熟的分化表型（收縮表型），常常表達一組獨特的收縮功能蛋白為主如SM22α、平滑肌肌動蛋白α（α 平滑肌）、平滑肌肌球蛋白重鏈（SMMHC）、鈣調節蛋白（calponin）等，表現為極低的增殖遷移、低成活性［17］。其中，SM22α 蛋白是一種收縮型VSMCs 標志物，參與收縮信號轉導的調節，過表達SM22α 可干擾PDGF-BB 誘導的Ras-Raf-1 信號轉導復合物的形成，阻斷MEK1/2-ERK1/2 增殖信號級聯的激活；進而抑制VSMCs 增殖、遷移和內膜增生［18-20］。然而，SM22α-/-Apo E-/-小鼠的VSMCs 增殖遷移能力增加，動脈粥樣硬化病變進展更快［20］。因此，SM22α表達異常與平滑肌細胞異常增殖與遷移密切相關。近年的研究表明［12］，青蒿素可以抑制血管平滑肌的SM22α 表達下調，從而抑制VSMCs 表型轉化，進而達到抑制血管平滑肌細胞增殖、遷移和去分化的作用，從而減緩Apo E-/-小鼠動脈粥樣硬化進展。

本研究發現，自體靜脈移植術后靜脈橋組織的平滑肌細胞的胞質有SM22α 表達。并且移植術后2 周后，與對照組相比，實驗組靜脈橋內膜增生明顯減少的同時，組織中SM22α 蛋白表達也在抑制下調。這表明，SM22α 可能參與了靜脈橋內膜增生的發生與發展這一復雜病理生理過程，而青蒿素能夠抑制血管平滑肌細胞表型轉化的作用，從而抑制平滑肌細胞異常增殖和（或）遷移，進而減輕靜脈橋狹窄的發生，可能是產生這一效果的原因。具體的機制有待深入研究。

總之，本研究表明，青蒿素能抑制靜脈橋SM22α的表達下調，進而減輕新生內膜厚度，對靜脈橋狹窄的發生與發展有比較好的防治前景，但此實驗樣本量相對比較少，亦未進行細胞及其機制的探討，仍需進一步深入研究。