江蘇豬附紅細(xì)胞體16S rRNA 基因的序列測(cè)定及系統(tǒng)進(jìn)化分析

夏 葉,孫瑩慧,李春華,郭佳宏,王秀花,繆德年*

(1 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,上海 201106;2 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海種豬工程技術(shù)研究中心,上海 201106)

附紅細(xì)胞體病(Eperythrozoonosis)是由寄生于紅細(xì)胞表面、血漿及骨髓內(nèi)的附紅細(xì)胞體導(dǎo)致的一種人獸共患病[1],可造成動(dòng)物貧血,生長遲緩,肉、乳產(chǎn)量降低,繁殖能力下降等,還會(huì)誘發(fā)呼吸道和腸道等多種疾病,嚴(yán)重者甚至死亡[2-3]。 附紅細(xì)胞體不能體外培養(yǎng),無法研制疫苗,目前該病尚無很好的防控方法,一旦在豬場(chǎng)大規(guī)模傳播,很難得到及時(shí)控制。 近年來,附紅細(xì)胞體病在豬場(chǎng)的檢出率逐年增高,給畜牧業(yè)帶來很大經(jīng)濟(jì)損失。 豬體感染后,常呈隱性狀態(tài),在抵抗力降低或應(yīng)激狀態(tài)下發(fā)病,通常與其他疾病混合感染或繼發(fā)感染。 急性感染的豬體會(huì)產(chǎn)生高熱、呼吸抑制、眼周分泌物旺盛等癥狀,全身皮膚出現(xiàn)發(fā)紅或蒼白;慢性感染的豬體臨床癥狀不明顯,主要表現(xiàn)為孱弱、消瘦[4-5]。 本研究對(duì)江蘇省南通地區(qū)豬附紅細(xì)胞體流行毒株的變異情況進(jìn)行分析,以期為豬附紅細(xì)胞體病的有效防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

以南通地區(qū)某養(yǎng)豬場(chǎng)自然感染豬附紅細(xì)胞體的2 頭豬(姬姆薩染色鏡檢診斷為附紅細(xì)胞體陽性)為試驗(yàn)對(duì)象。

1.2 主要試劑

DNA 提取試劑盒、高保真聚合酶Prime STAR HS DNA、DNA 瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司,DL2000 DNA Marker 購于北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 16S rRNA 基因的擴(kuò)增

根據(jù)GenBank 中公布的豬附紅細(xì)胞體16S rRNA 基因核苷酸序列,利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)1 對(duì) 特 異 性 引 物, 上 游 引 物 F: 5 ’-CCGAAAGTCTGATGGAGCAATA-3 ’; 下 游 引 物 R: 5 ’-ATCTCAAGACACGAGCTGACGAC-3’,預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大小為695 bp,引物由鉑尚生物科技(上海)有限公司合成。

采集病豬血液,按照DNA 提取試劑盒說明書提取豬附紅細(xì)胞體基因組DNA,進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。 PCR反應(yīng)程序:98 ℃預(yù)變性2 min;98 ℃變性10 s,55 ℃退火10 s,72 ℃延伸1 min,30 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,割膠回收目的片段,送鉑尚生物科技(上海)有限公司測(cè)序。

1.4 序列比對(duì)和遺傳進(jìn)化分析

采用DNAStar 軟件對(duì)獲得的豬附紅細(xì)胞體16S rRNA 基因序列與國內(nèi)外已發(fā)表的具有代表性的豬附紅細(xì)胞體16S rRNA 基因序列進(jìn)行比較(表1)。 利用MEGA 5.10 軟件構(gòu)建進(jìn)化樹,進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

表1 豬附紅細(xì)胞體16S rRNA 基因來源Table 1 Sources of Eperythrozoon suis 16S rRNA gene

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR 擴(kuò)增結(jié)果

將2 份血液樣品的基因組DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),發(fā)現(xiàn)16S rRNA 基因的片段大小為695 bp 左右(圖1)。

圖1 豬附紅細(xì)胞體16S rRNA 基因的PCR 擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of Eperythrozoon suis 16S rRNA gene

2.2 16S rRNA 基因序列分析

測(cè)序結(jié)果表明,分離株P(guān)E1 和PE2 中擴(kuò)增得到的豬附紅細(xì)胞體16S rRNA 基因序列長度分別為695 bp 和672 bp。 圖2 顯示,分離株P(guān)E1 和PE2 的16S rRNA 基因核酸序列同源性為76.4%。

圖2 豬附紅細(xì)胞體16S rRNA 基因核苷酸序列的同源性分析Fig.2 Homology analysis of nucleotide sequence of Eperythrozoon suis 16S rRNA gene

2.3 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析

由圖3 可知,分離株P(guān)E1 與 PE2 的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。 分離株 PE1 與中國豬細(xì)小支原體分離株 ZJ JX9330 以及日本豬細(xì)小支原體分離株Morioka4、Morioka9 親緣性關(guān)系最近;分離株P(guān)E2 與意大利綠念珠菌支原體分離株398∕09C 親緣性關(guān)系最近。

圖3 豬附紅細(xì)胞體16S rRNA 基因核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of nucleotide sequence of Eperythrozoon suis 16S rRNA gene

3 討論

自1972 年我國江蘇發(fā)生第1 例豬附紅細(xì)胞體病后,目前已在山東、云南、廣東、內(nèi)蒙、湖北、新疆、安徽和北京等二十多個(gè)省市相繼出現(xiàn)了該病的報(bào)道[6-9]。 臨床上,豬附紅細(xì)胞體病通常與豬瘟、豬鏈球菌病、藍(lán)耳病、副豬嗜血桿菌病等混合發(fā)生或繼發(fā)感染。

附紅細(xì)胞體的感染途徑多樣,豬體可通過攝食污染的含血物質(zhì)、接觸污染器械或昆蟲傳播等方式感染附紅細(xì)胞體;也可通過母嬰垂直傳播方式感染[10]。 附紅細(xì)胞體可以存活于無感染癥狀的動(dòng)物體內(nèi),在動(dòng)物體遭遇應(yīng)激、長途運(yùn)輸、飼養(yǎng)管理不良或其他病原體刺激時(shí)發(fā)病[10],這類亞臨床感染的動(dòng)物被認(rèn)為是附紅細(xì)胞體的主要寄存宿主。 豬附紅細(xì)胞體病在各個(gè)季節(jié)均可發(fā)生,其中夏季感染率最高,春秋兩季次之,冬季較低[8]。 不同生長階段的豬體均能感染,哺乳仔豬和斷奶仔豬感染率最高,種母豬和育肥豬略低[8]。 抗血液原蟲藥物、抗生素類藥物等對(duì)豬附紅細(xì)胞體具有較好的殺滅作用,有研究表明,鹽酸多西環(huán)素療效最佳,可作為治療豬附紅細(xì)胞體病的首選藥物[11]。 近年來,非洲豬瘟肆虐,對(duì)我國的生豬養(yǎng)殖業(yè)造成了重大影響,而附紅細(xì)胞體感染會(huì)降低豬體免疫力,導(dǎo)致豬體感染非洲豬瘟的幾率增大。 因此,對(duì)附紅細(xì)胞體病進(jìn)行監(jiān)測(cè)和防控不僅是為了控制該病原本身,更是為整個(gè)生豬養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展保駕護(hù)航。

本研究從南通地區(qū)豬場(chǎng)得到的分離株P(guān)E1 與中國分離株、日本分離株位于同一分支,親緣關(guān)系最近,提示該分離株可能來自中國或日本;分離株P(guān)E2 與意大利分離株位于同一分支,親緣關(guān)系最近,提示該分離株與意大利株可能源于共同的祖先。 綜上,南通地區(qū)的豬附紅細(xì)胞體分離株來源復(fù)雜,包括東亞乃至歐洲,這可能與長三角地區(qū)貿(mào)易發(fā)達(dá)有關(guān)。 鑒于近年來生豬養(yǎng)殖業(yè)形勢(shì)嚴(yán)峻,豬附紅細(xì)胞體病對(duì)豬的生產(chǎn)性能影響顯著,并可能引起嚴(yán)重的繼發(fā)感染,因此,需對(duì)豬附紅細(xì)胞體進(jìn)行有效地監(jiān)測(cè)和防控,以助力生豬養(yǎng)殖業(yè)的快速恢復(fù)和可持續(xù)發(fā)展。