銀連祛風湯對慢性蕁麻疹小鼠模型Eotaxin、IL-4、D-二聚體和血常規相關指標的影響*

張雪峰 李 軍 陳素梅 胡 燕

1 江蘇省南通市海門區人民醫院 226000； 2 南通漢藥中醫醫院

慢性蕁麻疹是一種以瘙癢、風團為主要臨床癥狀的肥大細胞依賴性免疫炎性疾病[1]，嗜酸性粒細胞(EO)、嗜酸性粒細胞趨化因子(Eotaxin)、白細胞介素-4(IL-4)、D-二聚體(DDi)等可能在慢性蕁麻疹的發病過程中起重要作用[2-4]；實驗室檢測白細胞計數(WBC)和血小板計數(PLT)可用于診斷慢性蕁麻疹[5-6]。銀連祛風湯是治療慢性蕁麻疹的協定方劑，本研究構建了慢性蕁麻疹小鼠模型，觀察銀連祛風湯對模型小鼠血中Eotaxin、IL-4、DDi、EO、EO%和WBC以及PLT表達水平的影響，探討銀連祛風湯對慢性蕁麻疹的治療作用及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物:KM小鼠72只，體質量(20±2)g，28～31日齡，雌雄各半[購自南通大學醫學院實驗動物中心，動物合格證號：SCKX(蘇)2017-0023，使用許可證號：SYXK(蘇)2017-0046，動物實驗人員上崗證號：2100443、2091530]。

1.1.2 藥物與試劑:銀連祛風湯(處方：銀花10g、連翹10g、生石膏30g、生地30g、土茯苓30g、白蒺藜20g、地骨皮15g、地膚子15g、炒僵蠶15g、茵陳30g、丹皮10g、生甘皮5g)。地氯雷他啶分散片(海南普利制藥股份有限公司)，卵白蛋白[默克生命科學(上海)有限公司]；氫氧化鋁(AR級，源葉生物科技有限公司)；Eotaxin、IL-4、DDi試劑盒(上海勁馬實驗設備有限公司)。

1.1.3 儀器:流式細胞儀(型號：FACS Calibur，美國BD公司)；離心機[型號：0412-1，上海醫療器械(集團)有限公司手術儀器廠]；酶標儀(型號：ST-360，上?？迫A生物工程股份有限公司)；干式免疫散射色譜分析儀[型號：AS100，美艾利爾(上海)醫療器械銷售有限公司]；全自動血細胞分析儀(型號：XH-2000，日本希森美康)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組與模型制備:按隨機數字表法將72只KM小鼠隨機分為正常對照組(Ⅰ組)，模型組(Ⅱ組)，銀連祛風湯低、中、高劑量組(Ⅲa、Ⅲb、Ⅲc組)，陽性藥(地氯雷他啶)組(Ⅳ組)，每組12只(雌雄各半)。通過2次給小鼠腹腔注射卵白蛋白和氫氧化鋁懸液的混合液(0.1mg+0.1ml)來構建慢性蕁麻疹動物模型[7]，2次注射間隔10d。

1.2.2 給藥方法:人體每日攝入銀連祛風湯的量為220g生藥，人體每日攝入地氯雷他啶分散片的量為5mg(人體質量均以70kg計)。按體表面積折算，并用人和小鼠的等效劑量比值計算得：小鼠地氯雷他啶分散片的等效劑量為0.65mg/kg，小鼠銀連祛風湯的等效劑量為28.60g/kg。設定小鼠與人的銀連祛風湯等效劑量作為本實驗的中劑量，將等效劑量的一半量作為低劑量(14.30g/kg)，將等效劑量的雙倍量作為高劑量(57.20g/kg)。將低、中、高三個劑量組的銀連祛風湯生藥按常規方法制備并定溶至相應濃度的銀連祛風湯1 400ml備用。設定小鼠與人的地氯雷他啶等效劑量作為本實驗的陽性藥對照組劑量，即0.65mg/kg，臨用前將地氯雷他啶分散片溶于1 400ml水中。Ⅲa、Ⅲb、Ⅲc和 Ⅳ組小鼠在第1次注射混合液后的第6天灌胃給藥，1次/d，給藥劑量為0.02ml/g，Ⅰ組和Ⅱ組小鼠灌胃生理鹽水，均連續21d。第2、第3周分別稱小鼠體重1次，根據稱得的小鼠實際體重，對用藥劑量做適當調整。

1.2.3 觀察小鼠軀體情況:分別在各組小鼠接受第1次和第2次腹腔注射后的第2天觀察它們的飲食、大小便、呼吸、皮毛以及有無抓撓情況。

1.2.4 取材及測定:在最后一次給藥的第2天，分別于每只小鼠的腹腔注射20%烏拉坦(劑量：5ml/kg)，待小鼠麻醉后，經眼球摘除取血，每只小鼠分別取血2管(0.5ml/管)，其中一管進行離心(1 500r/min、30min)取血清，-80℃凍存，用于測定Eotaxin、IL-4、DDi的表達水平。Eotaxin、IL-4用酶聯免疫吸附法測定，DDi用干式免疫散射色譜法測定。均按試劑盒說明書提供的方法進行操作。另一管置于edta-k2紫色抗凝管中常溫保存，搖勻后檢測EO、EO%、WBC和PLT水平。

2 實驗結果

2.1 小鼠一般情況 各組小鼠在接受第1次注射后，僅Ⅲa組有1只小鼠出現輕度抓撓癥狀，其余小鼠均未出現明顯異常的陽性反應。各組小鼠在接受第2次注射后，Ⅱ、Ⅲa、Ⅲb、Ⅲc組均出現不同程度異常陽性反應，表現為煩躁不安、易驚、抓撓、皮毛光澤度變差等。

2.2 對小鼠血中Eotaxin、IL-4、DDi表達水平的影響 與Ⅰ組相比，Ⅱ組小鼠血中Eotaxin、IL-4、DDi的含量均顯著升高(P<0.01)。與Ⅱ組相比，Ⅲa、Ⅲb、Ⅲc組均能明顯降低模型小鼠血中Eotaxin、IL-4、DDi的水平(P<0.05或P<0.01)，且Ⅲa、Ⅲb、Ⅲc組間的治療效果呈現良好的劑量相關性，見表1。

表1 銀連祛風湯對小鼠模型血清中Eotaxin、IL-4、DDi水平的影響

2.3 對小鼠血中EO、EO%、WBC、PTL表達水平的影響 與Ⅰ組相比，Ⅱ組小鼠血中EO、EO%、WBC均顯著升高(P<0.01)，PLT顯著降低(P<0.01)。與Ⅱ組相比，Ⅲa、Ⅲb、Ⅲc組均能明顯降低模型小鼠血中EO、EO%和WBC的水平，升高PLT水平(P<0.05或P<0.01)，且Ⅲa、Ⅲb、Ⅲc組間的治療效果呈現良好的劑量相關性，見表2。

表2 銀連祛風湯對小鼠模型嗜酸性粒細胞計數、嗜酸性細胞比例、白細胞計數、血小板計數的影響

3 討論

小鼠腹腔注射卵白蛋白和氫氧化鋁的混懸液構建慢性蕁麻疹模型操作簡單，重現性好，是實驗室常用方法。本實驗中，各組小鼠在接受第1次注射后，僅Ⅲa組有1只小鼠出現輕度抓撓癥狀，其余小鼠均未出現明顯異常的陽性反應。各組小鼠在接受第2次注射后，Ⅱ、Ⅲa、Ⅲb、Ⅲc組均出現不同程度異常陽性反應，表現為煩躁不安、易驚、抓撓、皮毛光澤度變差等，與蕁麻疹特征基本符合，說明慢性蕁麻疹小鼠模型構建成功。

史立宏等人的研究認為[8]，慢性蕁麻疹患者血中Eotaxin的表達顯著增高，又因為Eotaxin對嗜酸性粒細胞具有特異性的趨化和調節作用，并釋放大量IL-4等Th2細胞因子聚集在炎癥部位[9]，破壞Thl/Th2的平衡，促發慢性蕁麻疹等過敏性皮膚病。因此，Eotaxin、IL-4水平升高與慢性蕁麻疹的發病密切相關。本實驗中，模型小鼠血中的Eotaxin、IL-4的表達水平增高。在接受銀連祛風湯治療后，模型小鼠血中Eotaxin、IL-4表達水平均顯著降低，與上述推論具有一致性。因此，Eotaxin、IL-4在血中的表達水平可作為慢性蕁麻疹的臨床診斷以及用藥療程的重要依據。王朵勤等人的研究認為[10]，DDi是一種被纖溶酶降解的纖維蛋白標志物，主要是通過外源性和內源性凝血機制共同作用而產生，對評估慢性蕁麻疹病情具有較高的參考價值。Fujii K等人[11]以及Asero R等人[12-14]的系列研究表明，慢性蕁麻疹患者DDi的表達水平明顯上調，血小板計數偏低，均與風團、紅斑等慢性蕁麻疹臨床癥狀的產生密切相關。目前較多的研究表明[15-16]，慢性蕁麻疹的患者血液中的嗜酸性粒細胞計數和比例均明顯高于健康人群，故其計數和比例的變化在慢性蕁麻疹的診斷及預后中具有重要的臨床意義。臨床上也可通過白細胞或者血小板計數等血常規指標來判斷慢性蕁麻疹患者是否存在炎癥反應。本研究中，模型組小鼠血中Eotaxin、IL-4、DDi、EO、EO%、WBC表達水平均明顯高于正常組，PLT明顯低于正常組，與前文討論具有高度相似性。在接受銀連祛風湯治療后，小鼠血中Eotaxin、IL-4、DDi、EO、EO%、WBC均明顯降低，PLT隨之升高，而且大劑量組的上述各項指標值基本接近正常值。銀連祛風湯低、中、高劑量組間的治療效果呈現良好的劑量相關性。提示上述各項指標均參與了慢性蕁麻疹的發生和發展過程。

中醫學認為，慢性蕁麻疹的發病大多是由于汗出當風、陰虛血燥、內生風邪、風寒夾濕、濕邪化熱所致[17]。本實驗中用到的銀連祛風湯是一中藥協定方劑，處方中銀花、土茯苓、生地、丹皮為君藥，四藥合用共奏消風除濕清熱涼血之功；連翹、石膏為臣藥，二藥合用共奏清熱瀉火之功；白蒺藜、地膚子合用共奏清熱疏風止癢之功；茵陳有清熱利濕之功；炒僵蠶有祛風止痛之功；地骨皮有清肺降火之功；生甘皮有理氣降逆之功，全方共奏涼血消風、祛風清熱、潤燥通里之功效。銀連祛風湯能通過降低模型小鼠血中Eotaxin、IL-4、DDi、EO、EO%、WBC水平，升高PLT水平，從病因學上抑制了模型小鼠的炎癥反應，從而發揮了治療作用。本項研究為皮膚科臨床使用銀連祛風湯治療慢性蕁麻疹提供了實驗依據。