原發性肝癌患者切除術前后Th1/Th2漂移的變化及與復發轉移的相關性研究

夏云展 李 瓊 李榮振 朱少功 李曉彥

鄭州人民醫院 1 普通外科 2 神經內科，河南省鄭州市 450003

肝癌是消化系統常見的惡性腫瘤之一，其中原發性肝癌最多見，其位居全球惡性腫瘤發病率第六位,也是癌癥致死的第三大死因[1-2]。我國是肝癌的高發國家，肝癌的新增病率及死亡率約占全球的50%[3]。目前手術切除是臨床治療原發性肝癌的首選方法，但術后的高復發率和死亡率是影響患者遠期生存質量的主要原因[4]。復發及轉移是影響患者預后的決定性因素，因此探究影響腫瘤復發轉移因素具有重要意義。研究已證實在肝癌患者體內發生Th1/Th2漂移[5]。肝癌患者腫瘤的轉移與T淋巴細胞亞群具有一定的相關性[6]。吳珊珊等[7]研究顯示肝癌術后患者外周血T淋巴細胞亞群與患者預后密切相關。而肝癌患者行腫瘤切除術后Th1/Th2漂移的變化與復發轉移的相關性研究鮮有報道。因此本研究探討Th1/Th2漂移變化對肝癌腫瘤復發轉移的影響，這對臨床工作者預測患者腫瘤復發轉移情況具有一定的指導作用，對提高患者預后的生存質量及延長患者生存率具有重要的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年10月—2019年10月在本院行腫瘤切除術的原發性肝癌患者86例作為研究組，其中女38例，男48例，年齡35～80歲，平均年齡(58.51±10.45)歲；TNM Ⅰ期12例，Ⅱ期17例，Ⅲ期49例，Ⅳ期8例；Child-Pugh A級22例，B級42例，C級22例。根據病情不同分別行根治性手術、部分切除術及姑息性手術治療。納入標準：(1)符合中國抗癌協會肝癌專業委員會制定的原發性肝癌相關診斷標準；(2)術前未接收過抗腫瘤藥物治療；(3)符合腫瘤切除術指征；(4)簽署知情同意書。排除標準：(1)合并心、腦、腎等重要臟器嚴重疾病者，合并免疫系統疾病及感染性疾病者；(2)合并其他腫瘤者。選取同期在本院進行體檢的健康者60例作為對照組，其中女29例，男31例，年齡29～76歲，平均年齡(57.00±12.30)歲，BMI 21.95±2.30。兩組一般資料差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2 研究方法

1.2.1 標本采集：在術前1d及術后1周采用肝素抗凝管采集患者空腹外周血，并收集同期門診體檢健康者外周血，均5ml。

1.2.2 血清IFN-γ、IL-4細胞因子指標檢測：采用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定各組血清中γ干擾素(IFN-γ)和白細胞介素-4(IL-4)指標水平。操作方法按試劑盒(北京索萊寶公司)說明書步驟進行。

1.2.3 Th1/Th2檢測：酶聯免疫斑點實驗(ELISPOT)檢測外周血Th1/Th2細胞比例。步驟如下：(1)淋巴細胞分離液分離淋巴細胞，操作步驟按照試劑盒(北京所索萊寶公司)說明書進行。(2)按照常規方法培養淋巴細胞。ELISPOT法檢測:①ELISPOT板(武漢三鷹公司)每空加入含5%的胎牛血清(美國Gibco公司)的RPMI1640細胞培基(北京所索萊寶公司)200μl，室溫5min。②1%的BSA(北京索萊寶公司)封閉30min。③PBS洗板，每空100μl淋巴細胞懸液，細胞濃度2×105個/孔，并設置對照孔，每空加入10μl特異刺激物，培養16～24h。④棄去培養液，洗板，加入鼠抗IFN-γ、IL-4抗體(美國abcam公司)，37℃孵育2h。⑤洗板，加入鏈霉親和素-HRP二抗(北京索萊寶公司)，室溫孵育2h。⑥洗板，加入底物顯色液，室溫避光待出現清晰斑點，去離子水終止反應，使用 ELISPOT reader進行斑點計數每個斑點代表一個特異性Th1或Th2細胞，并計算Th1/Th2細胞比例。

1.2.4 隨訪：于患者出院后采用電話或門診隨訪。患者隨訪截止時間為腫瘤復發轉移的時間，并記錄患者復發轉移情況，隨訪截至2020年10月。分析患者無復發轉移生存期。復發及轉移的判定標準：(1)外周血甲胎蛋白(AFP)再次升高超過400ng/L；(2)經影像學檢查發現腫瘤復發灶或轉移灶；(3)經病理學活檢診斷為原發性肝癌。

2 結果

2.1 兩組細胞因子及Th1/Th2值比較 與對照組相比，研究組術前及術后的 IFN-γ水平及Th1/Th2值均顯著降低(P<0.05)，IL-4水平顯著升高(P<0.05)；與術前相比，研究組術后IFN-γ水平及Th1/Th2值均顯著升高(P<0.05)，IL-4水平顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 兩組IFN-γ、IL-4水平及Th1/Th2比較

2.2 Th1/Th2平衡與復發轉移的相關性研究 運用Kaplan-Meier法分析結果顯示術前不同IFN-γ水平、IL-4水平及Th1/Th2比例患者無復發轉移生存期比較差異均無統計學意義(P>0.05)，見圖1a、b、c；而術后IFN-γ水平、IL-4水平及Th1/Th2比例的患者的無復發轉移生存期比較具有統計學差異(P<0.05)，見圖1d、e、f。運用COX回歸分析各指標對患者復發轉移的影響，單因素分析顯示，TNM分期、術后IFN-γ水平、IL-4水平及Th1/Th2比例可能是復發轉移的危險因素(P<0.05)，見表2。將單因素分析有意義的指標納入進行多因素回歸分析，結果顯示，術后Th1/Th2比例和TNM分期是影響患者復發轉移的獨立危險因素(P<0.05)，見表3。

表2 COX單因素分析

表3 COX逐步條件回歸分析多因素對無復發轉移生存期的影響

圖1 不同組患者的Kaplan-Meier生存曲線

3 討論

臨床研究表明腫瘤的發生發展與患者的免疫功能具有一定的關系。由于機體發生免疫抑制，使其免疫功能降低，特別是細胞免疫功能遭到嚴重破壞，則加快腫瘤的發展。Th細胞是機體重要的免疫調節細胞，其是維持機體抗腫瘤反應和長期存活率的關鍵[8]。Th1細胞和Th2細胞是Th細胞的主要亞群，Th1細胞主要分泌TNF-γ等細胞因子，其介導細胞免疫反應，在外源性病原體和腫瘤免疫防御中發揮作用。Th2細胞主要分泌IL-4等細胞因子，刺激B細胞增殖和抗體產生，主要介導的是體液免疫反應，其可抑制Th1細胞免疫反應。正常情況下，Th1/Th2平衡在維持機體免疫功能狀態中起著關鍵作用。機體發揮抗腫瘤的作用主要是啟動Th1細胞免疫為主的細胞免疫反應[9]。而在腫瘤患者體內Th2細胞水平處于高表達，機體的細胞免疫功能受到抑制，從而引起腫瘤的發生。研究已經證實腫瘤的發生發展與Thl/Th2比例失衡有關[10]。研究發現喉癌患者外周血中Th1細胞因子水平顯著降低，而Th2細胞因子升高，出現Th1/Th2比例向Th2漂移[11]。研究已證實肝癌的發展與Th1/Th2比例失衡有關[12]。Saxena R等研究[13]發現肝癌患者中Th1型細胞因子TNF-γ水平顯著降低，Th2型細胞因子IL-4水平顯著升高，Th1/Th2失衡，發生Th1/Th2漂移。Ji L等研究[14]發現肝癌患者Th2細胞及細胞因子水平高于Th1細胞，Th1細胞免疫發生抑制。 Th1細胞可通過分泌TNF-γ刺激NK細胞及CTL細胞的活化，起到殺傷腫瘤細胞的作用；而Th2負向調控Th1細胞，不利于機體抗腫瘤反應的發生，因此抑制Th1/Th2向Th2漂移，反之向Th1漂移，可增加抗腫瘤免疫反應。本研究結果顯示，肝癌患者術前術后TNF-γ水平及Th1/Th2比值均顯著低于健康對照組，IL-4水平則高于對照組，這說明肝癌患者體內Th1細胞水平降低，Th2細胞水平升高，細胞免疫受到抑制，發生Th1/Th2值向Th2漂移，與前期研究結果相符合；術后TNF-γ水平及Th1/Th2比值均高于術前，IL-4水平則降低，這說明術后可刺激Th1細胞的增殖及細胞因子的分泌，抑制Th2細胞的分泌，產生Th1/Th2比例向Th1漂移的免疫應答，證實肝癌切除術可扭轉Th1/Th2漂移，改善患者的免疫功能，提高患者的抗腫瘤的能力。

腫瘤的復發轉移與機體的免疫狀態密切相關[15]。Thl/Th2失衡將導致腫瘤細胞發生免疫逃逸，抑制Thl型細胞產生，削弱機體細胞免疫功能，導致腫瘤的復發轉移，影響預后。研究發現腫瘤的復發轉移與Th1/Th2失衡有關[16]。Th1/Th2漂移程度可反映疾病的嚴重程度，Th1/Th2值越小表示機體的免疫狀態越差，預后則越差，反之則相反[17]。大量研究表明肝癌患者的預后與多種因素有關[18]。研究顯示Ⅰ、Ⅱ期腎癌患者預后生存期高于Ⅲ、Ⅳ期的患者[19]。本研究結果顯示，TNM分期是術前術后患者腫瘤無復發轉移生存期的危險因素，另外IFN-γ、IL-4水平及Th1/Th2比例是術后無復發轉移生存期的危險因素；多因素分析顯示，TNM分期和Th1/Th2是患者腫瘤復發轉移的獨立危險因素，這與以往研究結果相符。以上結果說明Th1/Th2與肝癌患者腫瘤的復發轉移有關。提示積極糾正Th1/Th2的漂移，對肝癌采取早期治療可更大程度的提高患者免疫功能，可降低患者的復發轉移，提高生存預后。

綜上所述，TNM分期、IFN-γ、IL-4水平及Th1/Th2值與患者無復發轉移生存期有關，TNM分期和Th1/Th2值是影響腫瘤復發轉移的獨立危險因素，TNM分期和Th1/Th2比例可作為腫瘤復發轉移的預測指標，對提高患者生存預后具有重要價值。