不同添加量的聚-β-羥基丁酸酯作為生物絮凝緩釋碳源的應用效果

吳 霞，吳長勝，王國慶，羅國芝 ，2，3，譚洪新 ，2，3

(1 上海海洋大學 上海水產養殖工程技術研究中心，上海 201306；2 上海海洋大學 農業農村部淡水水產種質資源重點實驗室，上海 201306；3 上海海洋大學 水產科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306)

生物絮凝技術(Bio-floc Technology，BFT)通過向養殖水體添加有機碳源來提高養殖水體的碳氮比(C/N>15)[1]，培育系統自身對于氨氮的控制能力，形成細菌、原生動物、有機顆粒物等聚焦而成的生物絮團[2-3]，獲能的異養細菌得到較高的生長速率獲得優勢生長，構建了水體中穩定的微生物群落抑制病原體的生長[4-5]。

碳源的選擇對養殖對象的生長、絮團營養組分及水質都可能產生影響[6-8]。傳統碳源主要有葡萄糖、淀粉、糖蜜等[9-10]。可生物降解聚合物(Biological degradable polymers，BDPs)作為生物絮凝養殖模式的緩釋碳源時可以避免過量添加、添加不足或難以計算等問題[11]。聚己內酯(Polycaprolactone，PCL)被證實可以成為水產養殖中進行異養反硝化的優質碳源[12]。Qiao等[13]研究表明，養殖過程中在飼料中添加4%的聚-β-羥基丁酸酯(Poly-β-hydroxybutyrate，PHB)可以顯著改變養殖生物的腸道微生物結構，上調相關免疫基因表達，PHB在水體中也可作為微生物集聚的媒介。BFT形成生物絮體時水體中的糞便和殘飼也得以被重新利用，形成的生物絮團也可被濾食性養殖對象攝食[14]，PHB作為微生物介導的緩釋碳源在水體中降解緩慢不會留下過多殘余[15-17]。張楠等[18]研究了PHB與傳統碳源葡萄糖作為生物絮凝碳源對羅非魚養殖效率的影響對比，羅非魚的生長指標并沒有出現顯著差異，且使用PHB代替傳統碳源可以在養殖階段維持水體C/N適宜。

目前有關PHB作為生物絮凝碳源的研究，多集中在PHB作為生物絮凝系統緩釋碳源的可行性的探索階段，缺少PHB作為生物絮凝系統緩釋碳源投放策略的進一步研究。本研究以PHB作為生物絮凝的緩釋碳源，研究不同添加量的PHB作為BFT碳源對羅非魚生長及對生物絮凝系統的影響，尋求PHB作為BFT碳源的適宜添加量。

1 材料與方法

1.1 試驗裝置

試驗在上海海洋大學養殖工程與技術實驗室循環水養殖研發中心進行。養殖裝置為9個白色牛筋塑料桶，其規格為上外徑為65 cm，上內徑58 cm、下外徑51 cm、下內徑50 cm、高度76 cm、質量4.5 kg。養殖桶容積150 L，試驗所用工作容積120 L。所有養殖桶安置在室內環境中，養殖桶上方全程蓋上配套桶蓋。養殖桶連接羅茨鼓風機(型號HG-750，浙江森森森股份有限公司)，桶內接入一個直徑為50 mm的面包形曝氣石，沉于桶底正中央使得各桶獲得足夠的溶氧及使絮團懸浮的攪拌力。

PHB購自廣東迪捷塑化有限公司，為白色米粒狀結晶顆粒，長度3～5 mm，中心橫切直徑約3 mm，經純水2～3次清洗后經過45℃恒溫烘箱烘干至恒重后備用。

試驗用魚為吉富羅非魚(GIFT Oreochromis niloticus)取自上海海洋大學濱海養殖基地，運回實驗室后在循環水系統中暫養至(8.97±2.53)g/尾。使用預先培育好的生物絮團。暫養及試驗期間用于投喂羅非魚的飼料皆為通威股份有限公司出產的魚用膨化配合飼料“魚倍健150”。

1.2 試驗方法

試驗周期為48 d，在9個養殖桶接種預先培好的生物絮團，調控其絮團含量為300 mg/L。養殖的羅非魚初始質量為(8.97±2.53)g，每個養殖桶初始投放20尾魚苗。各組通過尼龍網袋分別按照約80 g/m3、200 g/m3、320 g/m3的比例添加PHB，添加量分別為A組10 g、B組25 g、C組40 g，每組3個平行。網袋懸于水體上層區域并于袋中置入4只玻璃珠用于幫助掛袋懸浮不受水體攪拌力的影響。

試驗期間每日按3.00%投飼量分早中晚3次投喂，每10 d隨機稱重羅非魚，根據稱重結果進行投喂量的調整。每4 d測定堿度及總固體懸浮顆粒物(TSS)質量濃度，使用碳酸氫鈉以調整堿度，使堿度維持在150.00～300.00 mg CaCO3/L，將TSS維持在300～600 mg/L。

1.3 水質指標的測定

SR=(N2/N1)×100%

(1)

WGR=(W2-W1)/W1×100%

(2)

SGR=(lnW2-lnW1)/t×100%

(3)

FCR=F1/(W2-W1)

(4)

式中：SR—存活率；WGR—增重率；SGR—特定生長率；FCR—飼料系數；N1—投入養殖水體魚的數量，尾；N2—試驗結束后還存活魚的數量，尾；W1—投入養殖水體魚的初始質量，g；W2—養殖階段結束后魚的質量，g；t—養殖天數，d；F1—飼料投喂量，g。

1.4 絮團營養指標的測定

養殖階段結束后，養殖水經過自然沉降后過800目尼龍篩布濾出絮體，將絮體進行冷凍干燥48 h，利用粉碎機研磨至粉末狀，使用碳、氮元素分析儀測定絮體粉末碳氮元素的含量。粗蛋白使用凱氏定氮儀(Kjeltec2300)直接測定；取干燥恒重后的絮體粉末先在電爐進行5 min灼燒后轉移至馬弗爐(SR-JX3-9 箱式電爐)中，設置溫度260 ℃，灼燒5 h至恒重，根據差值測定其粗灰分，水解氨基酸參照國家相關標準進行檢測。

1.5 數據分析

在Excel軟件內進行相關試驗數據分析，并且使用 Origin2018以及Adobe Illustrator CC 2018 軟件進行相關的圖表繪制。試驗數值采用平均值±標準差(Mean±SD)的形式表示，采用IBM SPSS Statistics 23.0統計軟件對相關數據進行 ANOVA 單因素方差分析，(P<0.05)為差異性顯著，(P>0.05)為差異性不顯著。

2 結果

2.1 水質參數

如表1所示，試驗期間各處理組溶氧為7.69～8.62，pH的范圍在7.82～8.43，各組水溫維持在23.18～24.50℃。PHB添加量的不同對溶解性有機碳比總氮的比值有顯著影響，B組的碳氮比(DOC/TN)顯著低于A組及C組(P<0.05)。

表1 試驗期間各處理組水質指標的平均值Tab.1 Mean values of water quality indexes in different groups

圖1 養殖過程中各組三態氮及總氮的變化Fig.1 Dynamic changes of three-state nitrogen and total nitrogen in each group

由圖2可知，各組DOC質量濃度隨著試驗的進行出現了積累，B組及C組于試驗后第36 天開始出現下降后再上升的情況，B組于試驗后期積累程度更小，試驗結束后A組的DOC積累高于C組。隨著試驗的進行，A組試驗后期可以將碳氮比穩定維持在15以上的較高水平，C組碳氮比波動較為劇烈，部分時期無法維持碳氮比在15以上，而B組于試驗后期碳氮比無法穩定維持在15以上。

圖2 各組溶解性有機碳及溶解性有機碳比總氮的變化Fig.2 Changes of dissolved organic carbon and the ratio of dissolved organic carbon to total nitrogen in each group

2.2 羅非魚的生長指標

表2可知，各組羅非魚的生長指標在存活率、增重率及特定增重率上，組間差異不顯著(P>0.05)，B組存活率相對較低(P>0.05)，特定增長率相對較高(P>0.05)。C組的飼料系數顯著低于A組和B組(P<0.05)，不同添加量PHB對羅非魚的生長指標并不產生顯著影響。

表2 羅非魚的生長指標Tab.2 Growth indexes of tilapias during the experiment

2.3 PHB的降解情況

各組試驗前后PHB的質量及耗損情況如表3所示，不同添加量的PHB作為系統碳源出現不同程度的降解耗損，降解耗損量差異顯著(P<0.05)，降解耗損量上整體呈現為A組0.05)，其中A、B組耗損率高于C組(P>0.05)。

表3 各組PHB試驗前后質量、試驗后降解耗損質量及耗損率Tab.3 The quality of PHB before and after the experiment,the quality of degradation and loss after the experiment,and the loss rate

圖3為試驗前后各組PHB掃描電鏡檢測結果，圖3d為試驗前未使用的PHB通過掃描電鏡對其表面進行觀察，PHB表面皆呈現為光滑平坦，無明顯孔徑。70倍放大下，各組的PHB表面均出現的明顯的蜂窩狀孔徑。6 k及20 k倍放大下掃描成像可見，A組的PHB表面呈現出B組及C組沒有的蜂窩狀凹陷，B組及C組之間PHB表面破損情況在掃描電鏡放大60 k及20 k倍放大成像下差異不顯著，可見隨著PHB添加量的減少，較低的PHB作為碳源，PHB顆粒的降解破損程度更高。

圖3 各組PHB掃描電鏡圖Fig.3 PHB scanning electron micrographs of each group

試驗后，各組PHB及未作為碳源的PHB做紅外光譜檢測，檢測圖譜如圖4所示，PHB紅外譜圖中1 452 cm-1和1 387 cm-1處的峰值與-CH3和-CH2基團對應，2 946 cm-1處的峰值對應的是烷基-CH3基團的延伸波段[21]。各組PHB與未經歷降解的PHB主要吸收峰值基本保持一致。可見PHB作為碳源經過降解后其分子結構及主要化學鍵并未改變。

圖4 各組PHB紅外光譜掃描圖譜Fig.4 Infrared spectrum of PHB of each group

2.4 絮團營養成分分析

如表4試驗前后各組絮團組分指標所示，B組粗灰分含量(33.64±3.03)%顯著低于試驗前絮團中的粗灰分含量(39.25±0.45)%(P<0.05)，各組之間C/N、粗蛋白及粗灰分含量無顯著差異(P>0.05)，C組試驗后C/N相對較低而粗蛋白相對較高(P>0.05)。A、B和C組組間粗脂肪含量差異不顯著(P>0.05)。試驗前后，A組粗脂肪皆高于B、C組，試驗后各組的粗脂肪相比與試驗前出現量不同程度的升高(P>0.05)。

表4 試驗前后各組絮團組分指標Tab.4 Index of group floccules before and after the experiment

對比試驗前絮團，試驗后各組生物絮團中的17種氨基酸的相對含量如表5所示。試驗后的各組絮團的必需氨基酸Thr、Phe、His及非必需氨基酸Asp、Cys、Tyr較試驗前出現的顯著下降(P<0.05)。試驗前生物絮團的非必需氨基酸Ser顯著低于試驗后各組生物絮團Ser的相對含量(P<0.05)。必需氨基酸Thr、Phe、His、Asp、Cys、Tyr的相對含量試驗前后及組間無顯著差異(P>0.05)，必需氨基酸Glu、Gly、Ala試驗前后及組間無顯著差異(P>0.05)。試驗后的B組的必需氨基酸Met的相對含量顯著高于C組，A組及C組Met相對含量差異不顯著(P>0.05)，不同的PHB添加量對胱氨酸Cys相對含量影響顯著(P<0.05)。

表5 試驗前后各組17種氨基酸相對含量(%)Tab.5 The relative content of 17 amino acids in each group before and after the experiment(%)

3 討論

3.1 各組PHB作為系統碳源的損耗情況

不同的投放量的PHB作為BFT系統的碳源，各組損耗質量出現顯著差異，3組的降解耗損質量隨著PHB的投放量增加而增大。而PHB表面的降解破損程度并不是隨著添加劑添加量的提高而增高，A組的損耗質量最少但PHB表面形成了更為明顯的蜂窩狀孔徑。陳珊等[23]研究表示，PHB是由外部的非結晶部分及內部的結晶部分組成，而內部結晶易降解程度更高。由此可知，PHB是一種內外部分結構致密程度不同的物質，微生物附著于PHB表面會首先降解表面的非結晶部分，其次是內部結晶部分，因此系統中的微生物為了獲得足夠的碳會優先利用到PHB內部的結晶部分，內部的結晶部分更易受到降解，形成的孔徑又可在PHB表面加大與水體接觸面從而附著更多的微生物，進一步促進A組的降解。因此A組的PHB表面破損程度更高。

3.2 不同PHB作為碳源對羅非魚養殖及系統水質的影響

本試驗經過48 d的養殖周期，各組存活率、增重率及特定增長率差異均不顯著，與邵李娜等[15]使用BHPV作為碳源養殖斑點叉尾研究結果相同，考慮可能是養殖周期短的原因。

氨氮及亞硝酸鹽氮是水產養殖的重要指標，因其對系統及養殖對象等毒害作用需要進行持續監測[23-26]。試驗開始的20 d后TAN的峰值隨著PHB添加量的減少而提高，C組的水質相對更加穩定，但試驗期間各組TAN均處于低于2 mg/L的較低范圍內。亞硝酸鹽氮質量濃度各組試驗期間低于0.5 mg/L。由陳偉等[27]研究表明，添加碳源有助于反應器TN的去除，各處理組之間TN的去除隨著C/N的升高，去除率也逐漸升高，與本試驗結果相同。

基于BFT的水產養殖系統中實時監測C/N非常困難，不論是水溶性碳源還是PHB作為碳源C/N隨著碳源的添加或消耗以及魚飼料或糞便中的氮素水平都會不斷變化。因此各組PHB釋碳量的差異并不是造成組間DOC、DOC/TN的組間差異的唯一原因。但鑒于C/N對于BFT養殖模式的重要意義，依舊選用DOC/TN作為考察PHB作為碳源釋碳效果的重要指標。由于PHB的結構特點PHB內外部分釋放碳量存在的差異性，無法為水體在試驗開始的前期提供過多的碳[28-29]。試驗后期各組的DOC/TN水平出現顯著差異，B組的DOC/TN顯著低于其他兩組，A組已經開始降解內部結晶部分，釋碳量加大，而C組由于投放量大，PHB與水體接觸面積更高，使得C組相較于B組于同一時間時降解更充分。A組PHB降解損耗質量最小，但試驗期間可以將C/N穩定維持在15以上，而B和C組于試驗期間無法穩定維持C/N在較高水平。結合各組PHB降解消耗質量的結果，從使用最優化的角度出發，按80 g/m3的添加比例添加PHB為更好的選擇，另外關于使用量的進一步減少是否合適也有待在后續試驗中進一步進行。

3.3 不同PHB添加量對絮團的營養組分的影響

有相關研究表明絮團的粗蛋白含量在38.5%～57.4%，粗灰分<20%，粗脂肪在20%～35%,能量在 20～25 kJ/g[30]。本試驗的研究結果表明不同添加量的PHB作為BFT的碳源對系統絮團的粗蛋白、粗灰分及粗脂肪的含量并不會造成顯著影響。考慮本身PHB的消耗量較少無法對絮團產生顯著影響，且 PHB作為中微生物介導的緩釋碳源，本身在釋放碳的過程中不會在水體中形成過多殘留，因此各組絮團營養組分差異不顯著。因此相較于水溶性的碳源只要保證適合的PHB添加量，不會產生碳源添加過量影響系統絮團穩定性。

4 結論

由于PHB自身結構特性，維持生物絮凝C/N的水平并不隨著添加量的提高而升高，當PHB的添加比例為80 g/m3時，可以在養殖過程中穩定維持生物絮凝系統較高的C/N，更有利于系統水質穩定，養殖適宜。

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