溫和灸對小鼠腹腔銅綠假單胞菌生物被膜感染的影響※

景 政,劉曉嵐,唐 妮,劉曉慶,荊雪寧,孔晉亮,宋志軍,吳 紅

(1.山東中醫藥高等專科學校,山東 煙臺 264199;2.廣西醫科大學第一附屬醫院,廣西 南寧 530021;3.丹麥西南日德蘭醫院,丹麥 埃斯比約 D K-6700;4.丹麥國家醫院,丹麥 哥本哈根 D K-2100)

銅綠假單胞菌是最常見的細菌生物被膜(BF)感染致病菌,也是臨床上最常見的條件致病菌之一。臨床上銅綠假單胞菌BF相關感染發生率高,而且極難根治。BF是細菌黏附于活性或惰性物體表面形成的高密度細菌團塊,并由自身產生的黏性胞外基質包裹著的具有三維立體結構的生物群體[1-2]。大量實驗表明,艾灸能抑制炎性反應,促使炎癥消散及破損病灶恢復,并且能顯著調節機體的免疫功能[2-8]。本實驗探討溫和灸在銅綠假單胞菌生物被膜感染的致病性方面的作用,對于臨床研究這種難治性院內感染尤其留置導管相關感染的發生、治療、預防均有重要的指導意義,現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 8～9周齡清潔級健康雌性昆明(KM)小鼠(18～22g)(由廣西醫科大學動物實驗中心提供,動物合格證號:SC X K桂2014-0002)。

1.2 實驗菌株 銅綠假單胞菌PAO1野生型(丹麥哥本哈根大學醫院臨床微生物科惠贈)。

1.3 BF載體 將一次性使用引流管(蘇州鑫達醫療器材有限公司)切割成5mm直徑的小圓片,高壓滅菌后備用。銅綠假單胞菌在37℃恒溫搖床中培養20h,將細菌濃度調整至所需的O D600＝0.05,用24孔板每孔分別加入2.0m L調好的菌液或生理鹽水,浸泡一次性引流管圓片,37℃恒溫培養20h,取出載體,0.9%氯化鈉注射液沖洗兩遍備用。

1.4 動物模型的建立 32只雌性KM小鼠飼養標準鼠糧、隨意飲水1周。按隨機數字表法分為空白對照組、PAO1組、PAO1灸組和空白灸組4組,每組8只。將4組小鼠用4%水合氯醛(0.10m L/10g)腹腔麻醉后,于左側下腹部局部消毒后切開約8mm切口,逐層分離進入腹腔,將BF載體用0.9%氯化鈉注射液輕輕沖洗后放入腹腔,縫合關腹。術后,艾灸組小鼠每日給予腹部溫和灸15min,飼養3d后處死小鼠。

1.5 藥物和器材 蘄艾條(蘄春藥圣草本科技有限公司,長200mm,直徑18mm)[9];試劑均為國產分析純;生物安全柜(蘇州凈化設備有限公司,BHC-1300 II A/B2);全自動血液分析儀(SY SME X,X T-2000 i),智能生化培養箱(常州市偉嘉儀器制造有限公司,SPX 250)。

1.6 指標檢測 小鼠腹腔銅綠假單胞菌生物被膜載體植入3d后取出,采用連續稀釋法計算活菌計數;檢測小鼠血常規、腹部病理學和細菌學改變(標本選擇載體及其周圍組織等)。

1.7 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件處理數據,計量資料以均數±標準差(±s)表示,采用t檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

(1)載體活菌計數 PAO1灸組載體活菌計數為(5.24±0.17)CFU/m L,明顯少于PAO1組(5.92±0.29)CFU/m L(P＜0.01),空白對照組、空白灸組均未培養出活菌。

(2)血常規結果 PAO1灸組、PAO1組、空白灸組白細胞計數均高于空白對照組(P＜0.05),且PAO1組白細胞計數低于空白灸組(P＜0.05);PAO1灸組、PAO1組單核細胞比值均高于空白對照組(P＜0.05),且PAO1組高于空白灸組(P＜0.05)。見表1。

表1 4組小鼠腹腔植入細菌生物被膜載體后血常規結果比較(±s)

表1 4組小鼠腹腔植入細菌生物被膜載體后血常規結果比較(±s)

注:與空白對照組比較,△P＜0.05;與空白灸組比較,▲P＜0.05。

組別 只數 白細胞計數(109/L) 單核細胞比值(%)PA O 1灸組 8 4.89±0.55△ 8.25±1.37△PA O 1組 8 3.61±0.64△▲ 10.28±2.68△▲空白灸組 8 4.03±0.41△ 3.65±1.49空白對照組 8 2.86±0.80▲ 5.54±1.65

(3)腹腔感染組織病理學改變 空白對照組未見明顯炎性反應。與空白對照組比較,PAO1組腹腔載體附近組織炎性反應嚴重,可見大量中性粒細胞、巨噬細胞等炎細胞浸潤;與PAO1組比較,空白灸組組織炎癥明顯減輕。掃描題目右側二維碼查看圖1—4。

3 討論

銅綠假單胞菌是免疫缺陷患者院內感染和致命感染的常見病原菌之一,可引起慢性感染。隨著生物醫學材料的廣泛使用,相關的臨床感染也日益增多,能引起許多慢性感染,如慢性呼吸系統感染、慢性泌尿生殖系統感染、牙周炎及體內留置導管等的感染等。銅綠假單胞菌是常見的BF相關感染病原菌之一。臨床抗感染的經驗證明,單一抗生素對大多數革蘭氏陰性菌,尤其是銅綠假單胞菌的治療是不理想的,因其會很快出現耐藥株,從而導致治療失敗。因此,銅綠假單胞菌慢性感染的研究已成為醫學及相關學科等眾多領域關注的熱點課題。

灸法是利用陳艾葉制成的艾絨柱或艾條,在選定的穴位皮膚表面上點燃或熏灸,借艾火的熱力透入肌膚,通過溫熱刺激產生溫經散寒、疏通經絡、調和氣血的作用,從而達到治病和保健作用的一種療法。灸法在針灸治療中屬于與針法互補的一種療法,灸法在現代臨床應用廣泛,治療以扶正為主,古有“七年之病,求三年之艾”“陷下則灸之”等描述,“扶助正氣”與臨床慢性感染治療多從提高細胞免疫力的思路類似。溫和灸通過艾灸的溫熱作用于穴位,對皮膚的溫熱刺激可以在局部引起血管擴張,加速血液循環,增強血液代謝,改善局部組織營養,加快組織中異常產物的吸收和清除[1-2]。除了改善血液循環、促進炎癥吸收外,溫和灸還能促進小動脈及毛細血管周圍白細胞移行、浸潤,增強吞噬細胞功能,促進抗體形成,增強免疫功能,故對淺層組織的慢性炎癥亦有效[3-4]。臨床報道中,溫和灸在新型冠狀病毒、慢性結腸炎及氣管哮喘慢性持續期等疾病的治療中,發揮了獨特而有效的作用[6-8]。?本草綱目?記載艾葉:“自成化以來,則以蘄州者為勝,用充方物,天下重之,謂之蘄艾。”蘄艾,性溫、苦、辛、微甘,具有鎮痛、抗炎、抗氧化等藥理作用,其揮發油、總黃酮含量及藥理藥效均明顯優于其他地區所產艾葉[9-10]。本實驗以蘄艾艾條為工具[9],根據本課題研究實際需要設計了一種動物用艾灸懸掛裝置(專利號:Z L 201920668212.5),艾灸過程中盡可能避免因為灸量及時間差異帶來的實驗影響,通過實驗數據表明,溫和灸后小鼠血液白細胞數量明顯增多,溫和灸治療對假銅綠單胞菌生物被膜感染引起的腹腔炎癥有明顯的抑制和治療作用,對溫和灸抑制炎性滲出及促進痊愈可能是通過提高白細胞數量及提高相關免疫機制提供了實驗支撐。相關實驗研究也表明,針灸可使免疫反應趨于平衡,調節嗜酸粒細胞、巨噬細胞的數量,減少B淋巴細胞分泌免疫球蛋白E等,說明針灸可對相關免疫細胞作用網絡進行多靶點和多環節的動態調控,從而發揮抑制慢性炎癥的作用[11]。本實驗結果也印證了采取溫和灸治療銅綠假單胞菌生物被膜感染有效,從而為臨床相關炎癥治療采取溫和灸治療提供理論基礎。目前,國內外對此類感染的艾灸治療研究報道極少。艾灸治療安全經濟、療效穩定可靠,對臨床這種難治性感染的防治指明一個新的方向。