微管不穩定蛋白在肺腺癌中的臨床及生物學意義

王清 王宋平 曾超龍

（1 西南醫科大學附屬醫院呼吸一科,四川 瀘州 646000;2 成都市龍泉驛區龍泉平安社區衛生服務中心住院部;3 成都市溫江區天府街道社區衛生服務中心）

肺腺癌是常見的肺臟原發惡性腫瘤之一〔1〕，惡性程度高，疾病進展速度快，現有的治療手段尚不能取得滿意的遠期療效〔2〕。因此，探究肺腺癌的分子疾病特征對提高我國肺癌治療水平有重要價值。微管不穩定蛋白（Stathmin）是一種進化上高度保守的可溶性蛋白質〔3〕，研究發現Stathmin 在骨肉瘤〔4〕、食管癌〔5〕中有促癌作用。但Stathmin 在肺腺癌中的表達、臨床價值及生物學功能尚未見報道。本研究通過臨床數據分析及體外細胞學實驗等方法，旨在初步探索Stathmin 在肺腺癌中的臨床價值及對肺腺癌細胞遷移和侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2015 年1 月1 日至2017 年1 月1日西南醫科大學附屬醫院胸外科行手術切除的肺腺癌組織及對應癌旁組織標本50 例，患者年齡45～72 歲，中位年齡為54 歲。兔抗人SP 免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物科技有限公司；A549 細胞購自蘇州思瑞坦細胞公司；Stathmin 一抗（ab52630）購自美國Abcam 公司；RNA 提取試劑Trizol（#15596026）、轉染試 劑 LipofectamineTM3000（#L3000015）及RT-PCR 試劑盒（#10928042）均購自美國Invitrogen 公司；SYBR Green 實時熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）試劑盒（#1725120）購自美國BIO-RAD 公司；Stathmin 引物（上游5＇-TGATTCTCAGCCCTCGGT-3＇；下 游5＇-TCAAGACTTCCGCCTCAT-3＇），GAPDH 引物（上游5＇-CCAGGGCTGCTTTTAACTCT-3＇；下 游5＇-GGACTCCACGACGTACTCA-3＇）；Transwell 小室購自美國康寧公司；基質膠購自美國B&D 公司；Stathmin shRNA 質粒及陰性對照質粒購自廣州復能基因有限公司。

1.2 免疫組化檢測組織中Stathmin 表達 甲醛固定-石蠟包埋的組織切片常規脫蠟、水化及微波抗原修復，分別用3%過氧化氫及10%山羊血清封閉切片。用磷酸鹽緩沖液（PBS）溶液按1 ∶100 比例配制Stathmin 一抗工作液，覆蓋組織切片，4℃搖晃、孵育過夜。PBS 溶液洗凈未結合一抗后，使用辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗結合相應一抗，DAB 法顯示陽性蛋白。按文獻〔6〕方法計算切片染色得分:無陽性染色細胞為0 分，＜25%為1 分，25%～50%為2 分，51%～75%為3 分，＞75%為4 分。

1.3 逆轉錄實時熒光定量（qRT）-PCR 檢測Stathmin 表達 使用Trizol 試劑按操作指南提取A549細胞總RNA。取等量RNA 配制20 μl 的逆轉錄反應體系合成cDNA。cDNA 稀釋10 倍后取5 μl 配制實時熒光定量PCR 體系，按如下條件進行PCR:95℃預變性30 s，1 循環；95℃變性5 s，60℃退火延伸30 s，40 循環。以GAPDH 作為內參，采用2-△△Ct法計算Stathmin mRNA 的相對表達量。

1.4 質粒瞬時轉染 A549 細胞以過夜培養達50%～70%密度接種于6 孔板中。Stathmin 質粒轉染分組:陰性對照（sh-ctrl）組每孔加入4.0 μg 的陰性對照質粒及10 μl 轉染試劑，Stathmin（sh-Stathmin）組每孔加入4.0 μg 的Stathmin shRNA 質粒及10 μl 轉染試劑；以無血清DMEM 培養基調整終體積為2 ml/孔。轉染48 h 后進行下一步試驗。

1.5 Transwell 遷移與侵襲小室實驗 收集轉染48 h后的A549 細胞，以無血清DMEM 培養基重懸后調整細胞密度為1×105/ml，按250 μl 每孔接種于Transwell 小室上室中，24 孔板內每孔加入750 μl 含10%胎牛血清（FBS）的DMEM 培養基。培養箱內培養24 h 后棄去上室內培養基，PBS 洗滌2 遍后采用4%多聚甲醛固定，結晶紫染色，棉棒擦去上室面殘余細胞，在200×顯微鏡下觀察下室面細胞并計數遷移細胞數目。用1×DMEM 按8 ∶1稀釋50 mg/L 的基質膠，按100 μl 每孔包被Transwell 小室底膜上室面，4℃風干后放入24 孔板內，重復上述步驟，計數侵襲細胞數目。

1.6 統計學方法 采用SPSS22.0 軟件進行χ2檢驗、t檢驗、Kaplan-Meier 檢驗。

2 結果

2.1 Stathmin 在肺腺癌組織中的表達及臨床意義 肺腺癌組織Stathmin 平均表達水平（3.82±0.39）明顯高于對應癌旁組織（1.23±0.41，t=6.228，P=0.004）。見圖1。以肺腺癌組織Stathmin 平均表達值為截斷點，分為Stathmin 高表達組和Stathmin 低表達組。Stathmin 高表達與腫瘤淋巴結轉移密切相關（P=0.036）。見表1。Kaplan-Meier 分析顯示，高表達Stathmin 的肺癌患者術后總體生存期（HR=2.333，P=0.004）及無病生存期（HR=2.125，P=0.006）均較短。見圖2。

圖1 Stathmin 在肺腺癌組織中表達(DAB,×400)

圖2 Stathmin 表達水平對肺腺癌患者預后的影響

表1 Stathmin 異常表達在肺腺癌中的臨床意義〔n(%)〕

2.2 沉默Stathmin 抑制A549 細胞遷移和侵襲 sh-ctrl 組A549 細胞內Stathmin 表達水平（0.86±0.24）明顯高于sh-Stathmin 組（0.21±0.11，t=4.414，P=0.013）。見圖3。sh-Stathmin 組遷移細胞數目〔（21.11±3.25）個〕明顯低于sh-ctrl 組〔（42.38±5.01）個，t=2.511，P=0.032〕；sh-Stathmin 組侵襲細胞數目〔（10.29 ±2.04）個〕 明顯低于sh-ctrl組〔（23.46±3.18）個，t=2.623，P=0.028〕。見圖4。

圖3 Western 印跡檢測各組Stathmin 的表達

圖4 沉默Stathmin 表達影響A549 細胞遷移及侵襲(結晶紫,×200)

3 討論

生物學文獻〔7〕表明，Stathmin 是一種對生物體器官發育有關鍵調控作用的基因，其基因的突變、異常修飾及缺失將引起多種先天性疾病的發生。本研究結果證實Stathmin 高表達與腫瘤淋巴結轉移及患者不良預后密切相關。研究顯示，Stathmin 高表達的宮頸癌患者臨床分期及淋巴結轉移率更高、5 年生存率更低〔8〕，在胃癌〔9〕和結腸癌〔10〕中也有相似的研究結果。提示Stathmin 可能是一種潛在的腫瘤標志物。研究還顯示，Stathmin 在動物體內還有抑制腫瘤增殖的能力〔11〕。綜上，Stathmin 表達下調與肺腺癌惡性臨床特征密切相關，其作為一種促癌基因，在抗肺腺癌細胞轉移的過程中發揮重要作用。研究〔12，13〕結果指出miRNA 的異常表達可能是Stathmin 在腫瘤細胞中高表達的原因之一，值得在今后的研究中進一步探索。