類風濕關節炎患者血清細胞因子檢測與CD100 的相關性

周進 袁錕 劉巍 范建波 王雯雯 虞子良 周小鋼 徐大偉

（南通大學第二附屬醫院 南京醫科大學康達學院南通臨床醫學院 1 骨科,江蘇 南通 226001;2 風濕免疫科）

類風濕關節炎（RA）是自身免疫類疾病，發病率為0.32%～0.36%，發病率及致殘率均較高〔1，2〕。中國目前有（400～500）萬人患有類風濕疾病，主要發病有關節表現和關節外表現，關節表現以手關節為主，近端指間關節、掌指關節、腕關節有關節疼痛、腫脹，關節功能受限，關節變形及末端關節嚴重骨質疏松〔3〕；關節外表現包括眼部結膜炎、干眼癥及肺間質病變，腎臟壓迫，心臟壓迫及消化道壓迫，外周神經壓迫等關節肌肉表現，所以是全身性、多器官、多系統病變，致殘率較高，病程反復，但最終會造成小關節變形，提前干預對于治療RA 至關重要〔4〕。

RA 的發病機制與免疫細胞有關（T 淋巴細胞、B 淋巴細胞、單核細胞等），這類細胞在血液循環過程中，聚集到關節內從而激發炎癥。在RA 形成過程中起重要作用是異常增殖的炎癥細胞和炎癥介質相互作用。研究表明，RA 患者初期關節囊滑膜成纖維細胞層下血管網已出現血管增生現象〔5〕。這種血管的異常增生為RA 病程的發展提供至關重要的微環境基礎。新生血管網密度增加，形成血管翳〔6〕。密集的血管網為各種類型的免疫細胞到達關節腔提供了物理空間上的道路，關節囊內細胞表面表達的自身抗原又為吸引各種免疫細胞提供了化學成分上的引誘。從理論上講，治療RA 的關鍵在于兩個通路，一是提前干預，阻止血管翳的形成；二是中和抗體，阻斷免疫細胞趨化而來〔7〕。

分化抗原簇100（CD）100 在免疫細胞活化及免疫應答方面發揮了重要作用，被稱為軸突導向因子（Sema）4D，有兩種存在形式，一種以Ⅰ型跨膜蛋白存在于細胞膜表面，被稱為膜結合型CD100（mCD100），另一種是可溶型CD100（sCD100）游離于血清中〔8，9〕。CD100 結合CD72 可能會對B 淋巴細胞起到負調控作用，參與RA 的發病，抑制T 細胞來源的CD100 的功能或將成為非常有前景的治療RA 的方法。本文擬分析RA 患者血清細胞因子檢測與CD100 的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2019 年9 月1 日至2020 年6 月1日南通大學第二附屬醫院收治58 例RA 患者，包括活動期RA 患者26 例，穩定期RA 患者32 例，年齡60～72 歲，平均62.7 歲，男30 例，女28 例。體檢中心行常規體檢26 例為對照組，其中男12 例，女14 例，年齡61～70 歲，平均63.2 歲。符合《2018 中國類風濕關節炎診療指南》中活動期RA 診斷標準:晨僵（≥45 min）、滑膜炎憑證、典型放射學RA 骨破壞變化，出現1 個及以上關節腫痛，且排除其他疾病所致關節炎，紅細胞沉降率（ESR）≥40 mm/h、C 反應蛋白（CRP）＞15 mg/L。若部分標準欠缺，評分可用美國風濕學會（ACR）/歐洲抗風濕病聯盟（EULAR）2009 系統，總分≥6 分確診RA；RA 患者病情活動度的評估:DAS28=〔0.56×sqrt（T28）+0.28×sqrt（SW28）+0.7×Ln（ESR）〕×1.08+0.16，數值范圍為0～10。所有病例無尿蛋白、周圍神經病變、生物制劑應用史、藥物過敏史、肺間質纖維化等其他影響因素，所有人群精神認知正常，試驗前簽署知情同意。

1.2 主要試劑 淋巴細胞分離液（北京索萊寶公司）；R&D 公司重組人CD100；美天旎CD8+T 細胞分選試劑盒；粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GMCSF）、白細胞介素（IL）-6、IL-17 試劑盒（美國RB 公司）；武漢華美公司CD100、干擾素（IFN）-γ 和腫瘤壞死因子（TNF）-α 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒；美國BD 公司的抗CD3-APC、抗CD8-APC Cy7、抗CD100-PE 試劑盒；抗CD3/CD28（美國eBioscience 公司）；Abcam 穿孔素、顆粒酶B 酶聯吸附斑點試驗（ELISPOT）檢測試劑盒。

1.3 主要儀器 M680 型全自動酶標儀（美國Bio-Rad 公司）、SORVALL 高速低溫離心機（美國Kendor 公司）；FACS-Calibur 流式細胞儀（美國BD 公司）；ELISPOT 讀板儀（德國AID 公司）；磁力分離架（德國美天旎公司）。

1.4 血清的收集與保存 采集RA 患者和對照組靜脈血15 ml，保存于促凝管。2 h 內，4 000 r/min離心10 min，收集上層血清，置于1.5 ml 離心管中，編號。-80℃冰箱備檢、保藏。

1.5 外周血單個核細胞分離 外周血單個核細胞（PBMC）分離:選取淋巴細胞分離液、密度梯度離心法分離PBMCs。取5 ml 樣品，等體積無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋混勻、取5 ml 淋巴細胞上清分離液。20℃，3 000 r/min 離心25 min。吸取白膜層，收集PBMC。

CD8+T 細胞分選:用試劑盒進行分選，取1×107個PBMCs，3 000 r/min 離心15 min 棄上清，重懸細胞（40 μl 緩沖液），加生物素（10 μl）標記的抗體，混勻、4℃孵化5 min，加入緩沖液（30 μl），加20 μl CD8+T 細胞微球抗體（包含抗CD14、抗CD61、抗生物素），混勻，4℃孵育10 min。通過分離柱的未標記細胞，為富集的CD8+T 細胞。

1.6 構建直接接觸培養、間接接觸培養系統 按照王新偉等〔10〕的方法建立，HLA-A2 限制性RA 患者的CD8+T 細胞和HepG 細胞直接接觸和間接接觸培養系統。

1.7 細胞因子檢測 取GM-CSF、IL-6、IL-17 和TNF-α 試劑盒，嚴格按照說明書操作。采用ELISA，應用Bio-RAD 酶標儀測量450 nm 處吸光度值，并換算成濃度值。

1.8 CD100 和細胞因子表達檢測 血漿/培養上清細胞因子:酶標抗體工作液進行稀釋，洗滌液稀釋。標注標準品曲線，設立空白對照、選擇陰性對照，將100 μl 標準品和待測樣本加入反應孔中，封口。37℃，90 min 孵 育，吸 樣，加入洗 滌緩沖 液（250 μl/孔），吸出前浸泡1 min，吸干，洗滌5 次。加入生物素標記的二抗（100 μl/孔），封死，37℃孵育60 min，洗板5 次，加ABC 工作液（100 μl/孔），封孔，37℃孵育30 min，洗板5 次，加入TMB 顯色工作液（100 μl/孔），37℃避光反應，出現藍色梯度（標準品3～4 孔）、且有后3～4 孔差別不明顯，加入終止液100 μl TMB 每孔，30 min 顯色反應。計算酶標儀測定OD 450 nm 波長處吸光度細胞因子濃度。

1.9 CD8+T 細胞MFI 檢測 采用流式細胞儀，將PBMCs 轉入FACS 管中，1 000 r/min 離心5 min。PBS 洗滌2 次，加入滴加流式抗體稀釋液80 μl（抗CD3-APC、抗CD8-APCCy7、抗CD100-PE），加1 μl流式抗體，重懸，4℃避光孵育30 min，PBS 洗滌2次，2%多聚甲醛溶液固定，上機檢測分析結果。

1.10 顆粒酶B、CD8+T 細胞分泌穿孔素水平檢測 取PBS（100 μl/孔）至聚偏氟乙烯（PVDF）平板，室溫孵育10 min，吸凈液體，加入CD8+T 細胞（5×104個/孔），加抗CD3/CD28（終濃度1 μg/ml），設立陰性對照（無刺激源），37℃、5% CO2培養20 h，吸凈液體，加0.1%吐溫20 的PBS（100 μl/孔），4℃孵育10 min，并洗滌3 次。采用1% BSA 的PBS（10 ml）稀釋檢測抗體，稀釋檢測抗體，加入孔中（100 μl/孔），25℃孵育1.5 h，PBS 洗滌3 次，含0.1%吐溫20。稀釋的鏈霉親和素堿性磷酸酶（100 μl/孔），倍數為1 ∶5 000。室溫孵育1 h，洗滌3 次，吸凈殘留液，加入BCIP/NBT 顯色底物，5～15 min（100 μl/孔）后，顯色細胞數計數，采用ELISPOT 讀板儀。SFC=樣本SFC-陰性對照SFC，分析斑點形成數SFC。CD8+T 細胞受HLA-A02 限制，用sCD100 刺激24 h。清洗CD8+T 細胞兩次，直接接觸方式與人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）共培養，或間接接觸的方式。48 h 培養，收獲上清液。直接接觸共培養:HUVECs 的死亡是通過CD8+T 細胞分泌細胞因子來介導的穿孔素和顆粒酶途徑。以間接接觸共培養的方式，HUVECs 的死亡僅由CD8+T 細胞分泌細胞因子，不需要細胞直接接觸〔9〕。

1.11 統計學處理 采用SPSS21.0、Origin9.0 軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗、配對t檢驗及Wilcoxon 配對檢驗。

2 結果

2.1 CRP、ESR 水平、DAS28 檢測 活動期RA 組CRP、ESR、DAS28 水平顯著高于穩定期RA 組、對照組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組年齡、CRP、ESR 和DAS28 比較〔〕

表1 各組年齡、CRP、ESR 和DAS28 比較〔〕

與活動期RA 組比較:1）P＜0.05

2.2 各組細胞因子水平檢測 與穩定期RA 組和對照組相比，活動期RA 組血清GM-CSF、IL-6、TNF-α水平均較高（P＜0.01 ）；穩定期RA 組血清中GM-CSF、IL-6 和TNF-α 水平顯著高于對照組（P＜0.05），3 組IL-17 水平差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組血清GM-CSF、IL-6、IL-17 和TNF-α 水平比較(,pg/ml)

表2 各組血清GM-CSF、IL-6、IL-17 和TNF-α 水平比較(,pg/ml)

與對照組比較:1）P＜0.05，2）P＜0.01；與穩定期RA 組比較:3）P＜0.01

2.3 RA 患者血漿sCD100、IgA 水平檢測 對照組血漿sCD100 水平為（5.73±1.36）ng/ml，活動期RA組為（7.05±1.77）ng/ml，較RA 組顯著升高（P=0.002 6），穩定期RA 組為（6.01±0.95）ng/ml，較對照組顯著升高（P=0.047）。對照組血清IgA 水平〔（2.19±0.83）g/L〕低于活動期RA 組〔（3.40±1.50）g/L〕、穩定期RA 組〔（2.68±1.14）g/L〕，差異有統計學意義（P=0.033、0.041）。血清sCD100 水平與IgA 水平呈正相關（R2=0.542 2，P＜0.001），見圖1。

圖1 RA 患者sCD100 水平與IgA 水平的相關性

2.4 外周血CD8+T 細胞CD100 的MFI 值檢測 與對照組相比，活動期RA 組外周血CD100+CD4+T淋巴細胞表面100 的MFI 值明顯降低（P＜0.05），穩定期RA 組MFI 值明顯高于活動期RA 組（P＜0.05）。3 組外周血CD100+CD15+粒細胞、CD100+CD8+T 淋巴細胞、CD100+CD19+B 淋巴細胞、CD100+CD14+單核細胞表面CD100 的MFI 值差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 外周血各細胞亞群胞膜表面CD100 的MFI 值()

表3 外周血各細胞亞群胞膜表面CD100 的MFI 值()

與對照組比較:1）P＜0.05；與穩定期RA 組比較:2）P＜0.05

2.5 sCD100 刺激RA 患者CD8+T 細胞水平檢測 重組人sCD100 刺激24 h，從健康對照組和RA 患者中純化CD8+T 細胞。RA 患者T 細胞與對照組比較，CD100 刺激后CD8+T 細胞上清液中IFN-γ 和TNF-α 水平顯著升高（P＜0.01）。此外，CD8+T 細胞與對照組穿孔素和顆粒酶B 的水平相比，sCD100 刺激后產生增加（P＜0.01）。見表4。RA 患者與對照組相比，sCD100 刺激的CD8+T 細胞誘導靶細胞HUVECs 死亡率顯著高于無sCD100 刺激的對照組（P＜0.05）。在間接接觸共培養的方式下，sCD100刺激RA 組與對照組時，細胞因子誘導的HUVECs死亡無顯著差異（P＞0.05）。與直接接觸和間接接觸共培養方式的對照組相比，RA 組培養的上清液中IFN-γ 和TNF-α 水平顯著升高（P＜0.05）。CD8+T 細胞在RA 組和間接接觸共培養的對照組的刺激中，分泌IFN-γ 和TNF-α 也顯著增加（P＜0.05），見表5～7。

表4 重組人CD100 刺激CD8+T 細胞、TNF-α、INF-γ、穿孔素檢測及顆粒酶B 檢測()

表4 重組人CD100 刺激CD8+T 細胞、TNF-α、INF-γ、穿孔素檢測及顆粒酶B 檢測()

表5 不同培養方式靶細胞死亡率檢測(,%)

表5 不同培養方式靶細胞死亡率檢測(,%)

表6 不同培養方式IFN-γ 檢測(,pg/ml)

表6 不同培養方式IFN-γ 檢測(,pg/ml)

表7 不同培養方式TNF-α 檢測(,pg/ml)

表7 不同培養方式TNF-α 檢測(,pg/ml)

3 討論

本研究結果表明，細胞因子誘導RA 患者發生關節滑膜炎，RA 的活動度可借助GM-CSF、IL-6 及TNF-α 的水平進行判斷；GM-CSF 參與細胞因子網絡調控，與血清IL-6 和TNF-α 的水平呈正相關。

CD100 以軸突誘導因子方式，定向誘導軸突生長錐的生長。CD100 廣泛表達于靜息狀態下的B細胞、激活的T 細胞和自然殺傷細胞等。CD100 有固定在細胞表面的膜蛋白和可溶性CD100，只存在于病理狀態下，如炎癥和腫瘤。

RA 患者外周sCD100 上調，調節下調CD8+T 細胞上的mCD100，導致CD8+T 細胞的細胞毒性升高。重要的是，sCD100 刺激促進了CD8+T 細胞的細胞溶解活性使靶細胞的直接細胞毒性升高。CD100 發揮重要的 生物學活性，是免疫 調控分 子〔12〕。mCD100 脫落，逐漸形成細胞亞群CD8-CD100-T 細胞，用于控制病毒感染〔13〕。感染后的免疫應答可以檢測到CD100 的作用，增強B 細胞、自然殺傷細胞及CD8+T 細胞功能，加快病毒清除〔14，15〕。

RA 患者體內存在多種免疫分子表達。血清sCD100 表達水平在RA 患者中降低，水平升高是T細胞表面mCD100。機體免疫個體的差異，導致表達模式變化，降低的CD8+T 細胞表面mCD100 水平可能與mCD100 脫落有關〔16～18〕；穩定期RA 患者血漿sCD100 水平下降，CD8+T 細胞表面mCD100 水平升高。

由于CD8+T 細胞存在CD100 的受體CD72，RA患者的CD8+T 細胞分泌細胞因子增加，但殺傷靶細胞不足，可發揮細胞毒性作用。CD8+T 細胞功能難以保持，是受sCD100 表達減少影響，發生功能障礙。單核細胞、T 細胞、B 細胞、自然殺傷細胞等的表面表達mCD100。mCD100 脫落，sCD100 表達。CD100 在其他免疫細胞中的調控作用有待進一步研究。RA 的癥狀是由兩條通路，兩條通路的交匯點CD100 具有重要病理學價值，所以將CD100 作為治療的分子靶標，有很大可能減弱RA 的癥狀。

總之，改變mCD100 和sCD100 表達模式變化，以CD100 作為治療靶點，極有可能會大大減輕RA的癥狀，副作用也會較小，為未來治療RA 提供了有力的理論和實踐支撐。