蒙藥德都紅花-7 味散對CCl4 所致肝纖維化大鼠Bcl-2、Bcl-x 蛋白表達的影響

薛蘭 牧仁 徐艷華 陳紅梅 娜日蘇 巴圖德力根 韓志強

（1 內蒙古民族大學附屬醫院,內蒙古 通遼 028007;2 內蒙古民族大學）

肝纖維化（HF）在人群中的發病相當普遍。乙型肝炎和丙型肝炎是引起肝纖維化和肝硬化的最常見疾病。蒙藥德都紅花-7 味散組方由紅花、天竺黃、藍盆花、木通、地丁、訶子、麻黃等7 味蒙藥組成，具有清肝熱功能，主治新舊肝病，肝損傷，肝血熱、眼睛發黃〔1〕。前期研究表明德都紅花-7 味散有對四氯化碳（CCl4）所致肝損傷具有明顯的降酶、保肝、抗纖維化，促進HSC 細胞凋亡，抑制肝星狀細胞（HSC）細胞增殖的作用〔2，3〕。本研究探討蒙藥德都紅花-7 味散對CCl4所致肝纖維化大鼠Bcl-2、Bcl-x蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及用藥 SD 大鼠，雄性，SPF 級，體重180～220 g，許可證號:SCXKC（吉）-2018-0007，購自長春億斯實驗動物技術有限責任公司。水飛薊賓膠囊，國藥準字H2040299，天津天士力圣特制藥有限公司，批號:950 605007；德都紅花-7 味散，批準文號:內衛制字M13060134，購自內蒙古民族大學附屬醫院，批號20191224。

1.2 主要試劑及儀器 橄欖油（分析純），國藥集團化學試劑有限公司，批號20 190129；CCl4（分析純），天津市風船化學試劑科技有限公司，批號20191010。Bcl-2、Affinity、批號6139；Bcl-x、CST、批號2764。激光共聚焦顯微鏡，Nikon（Japan），Eclipse Ti-E；全景切片掃描儀，PM2235 萊卡組織切片機、EG1150H 萊卡包埋機，萊卡公司；圖片分析軟件Media Cybemetics（U.S.A），Image-Pro Plus6.0。

1.3 動物造模、分組、給藥 將34 只SD 雄性大鼠適應實驗室1 w 后，按體重分層隨機分為空白組、模型組、水飛薊素組、德都紅花-7 味散組，每組10 只。除空白對照組，其他組腹腔注射CCl4橄欖油溶液2.0 ml/kg，造模1～2 w 腹腔注射10%的CCl4橄欖油溶液每周2 次，3～4 w 腹腔注射15%的CCl4橄欖油溶液每周2 次，5 w 腹腔注射20%的CCl4橄欖油溶液2 次，6、7 w 腹腔注射15%的CCl4橄欖油溶液每周1 次。空白對照組和模型組灌胃蒸餾水，德都紅花-7 味散低劑量組按0.3 g/kg，水飛薊賓組21 mg/kg灌胃給藥，給藥7 w 后動物禁食12 h，取肝組織%多聚甲醛固定〔4〕。

1.4 肝組織組織病理學檢查 肝組織切片用4%多聚甲醛固定，組織脫水，透明，用石蠟包埋，切片，HE 染色，光學顯微鏡下觀察分析，肝損傷程度療效評價〔5，6〕。

1.5 免疫組織化學方法檢測大鼠肝組織中Bcl-2、Bcl-x 蛋白表達 取肝組織常規固定、脫水、透明、石蠟包埋，切片，抗原修復液，過氧化酶阻斷溶液阻斷內源性過氧化物酶的活性，第一抗抗體、第二抗體、鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液，二氨基聯苯胺（DAB）溶液，蘇木素復染，觀察結果。判讀抗體的胞質、胞膜染色的染色強度（0/1+/2+/3+）和染色陽性率，評分。

1.6 統計方法 采用SPSS20.0 軟件進行t及χ2檢驗。

2 結果

2.1 各組大鼠肝組織病理改變 HE 染色結果表明空白組肝臟組織被膜由厚薄均勻的富含彈性纖維致密結締組織構成，肝小葉分界明顯，排列規則，肝小葉中央為中央靜脈，周圍是大致呈放射狀排列的肝細胞和肝血竇，肝細胞排列規則、整齊，肝竇無明顯擴張或擠壓；相鄰肝小葉之間的門管區無明顯異常；未見明顯的炎性改變。模型組中央靜脈、匯管區周圍及肝實質內均可見大量的肝細胞脂肪變性，肝細胞內可見體積較小、數量不等的圓形空泡；中等量的匯管區周圍可見少量的炎性細胞浸潤；小葉結構紊亂，多見纖維間隔形成；未見明顯的細胞壞死。水飛薊賓組、德都紅花-7 味散組中央靜脈、匯管區周圍及肝實質內肝細胞顆粒變性明顯輕于模型組；小葉結構紊亂，多見纖維間隔形成與模型組比較較輕。見表1，圖1。

圖1 各組肝組織(HE 染色,×100)

表1 德都紅花-7 味散對慢性肝損傷大鼠肝炎癥活動度和纖維化分期的影響(n)

2.2 德都紅花-7 味散對大鼠肝組織Bcl-2、Bcl-x 蛋白表達的影響 與空白組比較，模型組Bcl-2、Bcl-x蛋白表達升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，水飛薊賓組、德都紅花-7 味散組Bcl-x、Bcl-2 蛋白表達下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2，圖2。

表2 德都紅花-7 味散對大鼠肝組織Bcl2、Bcl-x 蛋白表達的影響(,n=10)

表2 德都紅花-7 味散對大鼠肝組織Bcl2、Bcl-x 蛋白表達的影響(,n=10)

與空白組比較:1）P＜0.05；與模型組比較:2）P＜0.05

圖2 德都紅花-7 味散對各組肝組織Bcl-2、Bcl-x 蛋白表達的影響(DAB,×800)

3 討論

HF 繼發于各種原因，如酒精、肝炎病毒、代謝性疾病、自身免疫相關性疾病等引起的肝臟損傷組織修復過程中的代償反應，以細胞外基質（ECM）的合成與降解失衡、并在肝細胞間隙可逆性沉積為特征〔6〕。HSC 在HF 病理進程中發揮了重要作用。各種原因致使肝損傷后，造成肝星狀細胞激活，轉化為肌成纖維細胞，合成ECM 分泌增加，降解減少，以致大量的ECM 在肝內沉積，形成HF〔7〕。Bcl-2 蛋白家族是調控線粒體凋亡途徑的關鍵因子。抗凋亡的多結構域蛋白，主要是Bcl-2、Bcl-x。HSC 凋亡過程中Bax 的表達減少而Bcl-2 和Bcl-x 蛋白的表達增加〔8〕。本研究表明德都紅花-7 味散能夠明顯減輕CCl4所致大鼠的HF，降低肝組織Bcl-2、Bcl-x 蛋白表達。蒙藥德都紅花-7 味散能夠明顯減輕肝纖維化，其機制與調節抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-x 表達相關。