白花丹素通過調(diào)控Wnt 信號通路抑制肝癌MHCC97-H 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲

郭麗 趙虹 張俊濤 劉志貞 弓韜 于保鋒

（1 臨汾職業(yè)技術(shù)學(xué)院,山西 臨汾 041000;2 山西醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室）

肝癌分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩大類，其中原發(fā)性肝癌最為常見。肝細(xì)胞癌屬于原發(fā)性肝癌，占所有肝癌病例的90%以上。肝癌在世界范圍內(nèi)具有較高的患病率，是全球癌癥相關(guān)死亡率的第三大原因〔1〕。肝癌具有高度侵襲性、高復(fù)發(fā)率及高死亡率等特征，導(dǎo)致患者預(yù)后不良〔2〕。目前肝癌的治療主要包括外科手術(shù)、放療和化療等綜合治療方式，但患者5 年生存率仍不能令人滿意〔3〕。考慮到傳統(tǒng)化療和放療的細(xì)胞毒性及對患者的毒副作用，因此亟需尋找低毒、高效且毒副作用較小的藥物用于肝癌的治療。近幾十年來，中藥在腫瘤治療中展現(xiàn)出其獨特的優(yōu)勢，已受到廣大學(xué)者的廣泛關(guān)注〔4〕。白花丹素（PLB）是從天然中藥白花丹根部提取的有效活性成分，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、消腫等多種藥理學(xué)功能。近期研究發(fā)現(xiàn)，白花丹素在抗腫瘤中扮演重要角色，包括前列腺癌、乳腺癌和舌鱗狀細(xì)胞癌等〔5，6〕。目前尚未有報道闡明PLB 對肝癌MHCC97-H 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及機制。Wnt 信號通路是機體中重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在多種疾病中發(fā)揮重要作用，包括腫瘤〔7〕。研究顯示，Wnt 信號通路的異常激活與肝癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)〔8〕。因此，本研究旨在探究PLB 對人肝癌MHCC97-H 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及對Wnt 信號通路的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和主要試劑 人肝癌MHCC97-H 細(xì)胞株（中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫）；PLB、Wnt 激活劑氯化鋰（LiCl，美國Sigma 公司）；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco 公司）；胰蛋白酶（美國Corning Cellgro 公司）；CCK-8 試劑（日本同仁化學(xué)研究所）；孔徑為8 μm 的Transwell 小室、基質(zhì)膠（美國BD 公司）；除抗體外Western 印跡檢測所需試劑（上海碧云天生物技術(shù)研究所）；基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）；Wnt1、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）和生存素（Survivin）抗體及二抗（美國CST 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌MHCC97-H 細(xì)胞復(fù)制后培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中，放置在飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中，每隔2 d 更換1 次新的培養(yǎng)液，待MHCC97-H 細(xì)胞呈單層鋪滿培養(yǎng)瓶底90%以上時，使用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，以1 ∶3的比例進(jìn)行傳代，取生長狀態(tài)良好的MHCC97-H 細(xì)胞用于后續(xù)研究。

1.2.2 CCK-8 法檢測PLB 對MHCC97-H 細(xì)胞增殖的影響 對數(shù)生長期的MHCC97-H 細(xì)胞消化后計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個/ml，取200 μl 細(xì)胞懸液接種到96 孔板中，置37℃恒溫培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后除去舊培養(yǎng)液，更換成含不同濃度（0.0、0.1、1.0、5.0、10.0、20.0 μmol/L）PLB 的培養(yǎng)液，其中0.0 μmol/L 設(shè)為空白對照（Blank 組），于37℃培養(yǎng)箱分別孵育24、48、72 h，每個濃度的每個時間點設(shè)置3 個復(fù)孔，在各個時間點向各孔細(xì)胞中加入10 μl CCK-8 溶液，繼續(xù)孵育4 h，使用酶標(biāo)儀測定波長在450 nm 處細(xì)胞的吸光度值，分別計算PLB 對MHCC97-H 細(xì)胞增殖抑制率和干預(yù)48 h 半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.2.3 細(xì)胞分組 將對數(shù)增殖期的MHCC97-H 細(xì)胞隨機分為4 組:Blank 組、PLB 組、激活劑（LiCl）組和PLB+激活劑（PLB+LiCl）組。Blank 組MHCC97-H 細(xì)胞不作任何處理；PLB 組MHCC97-H 細(xì)胞以終濃度為4 μmol/L PLB 干預(yù)48 h；LiCl 組MHCC97-H細(xì)胞以濃度為20 nmol/L Wnt 激活劑LiCl 干預(yù)48 h；PLB+LiCl 組MHCC97-H 細(xì)胞以 終濃度 為4 μmol/L PLB 和濃度為20 nmol/L LiCl 干預(yù)48 h。

1.2.4 克隆形成實驗檢測MHCC97-H 細(xì)胞克隆形成能力 對數(shù)期的MHCC97-H 細(xì)胞按1.2.3 方法分組和處理后，以胰蛋白酶消化，按5×102/孔均勻的種植在6 孔板中，常規(guī)培養(yǎng)，每3 d 更換1 次新的培養(yǎng)液，14 d 后取出6 孔板，細(xì)胞用95%乙醇固定30 min，隨后用4 g/L 結(jié)晶紫染色15 min，用蒸餾水洗去染液，風(fēng)干后統(tǒng)計每孔中細(xì)胞克隆形成數(shù)，分別計算各組MHCC97-H 細(xì)胞克隆形成率，克隆形成率（%）=克隆形成數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.5 Transwell 實驗檢測MHCC97-H 細(xì)胞侵襲能力 Matrigel 基質(zhì)膠融化后用無血清的培養(yǎng)液稀釋成50 mg/L，鋪于Transwell 小室的上室基底膜進(jìn)行包被。各組MHCC97-H 細(xì)胞以胰酶消化，用無血清培養(yǎng)液饑餓處理12 h，將3×105個細(xì)胞接種到Transwell 小室的上室，下室緩慢加入600 μl 含15%胎牛血清的培養(yǎng)液，于常規(guī)培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育48 h，取出小室，用棉簽擦去未穿過基底膜的細(xì)胞，以甲醇固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，洗去染液，隨后在倒置顯微鏡下觀察穿膜細(xì)胞，分別計數(shù)各組穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 劃痕實驗檢測MHCC97-H 細(xì)胞遷移能力 對數(shù)期的MHCC97-H 細(xì)胞接種到6 孔板中，于37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞單層鋪滿底部約90%時，用滅菌的槍頭進(jìn)行劃痕，再用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細(xì)胞，將劃落的細(xì)胞洗去，隨后按照1.2.3 方法分組和處理48 h，分別在處理0 h 和48 h 時在顯微鏡下拍照，計算各組MHCC97-H 細(xì)胞相對遷移率，相對遷移率（%）=（0 h 劃痕距離-48 h 劃痕距離）/0 h 劃痕距離×100%。

1.2.7 ELISA 檢測上清液中MMP-2 和MMP-9 含量 MHCC97-H 細(xì)胞按1.2.3 法分組和處理48 h，分別收集各組細(xì)胞上清液，參照ELISA 檢測試劑盒使用說明書對MMP-2 和MMP-9 含量進(jìn)行測定。

1.2.8 Western 印跡檢測MHCC97-H 細(xì)胞中Wnt1、β-catenin 和Survivin 蛋白水平 MHCC97-H 細(xì)胞按1.2.3方法分組和處理48 h，收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取總蛋白，使用BCA 蛋白濃度檢測試劑盒對蛋白進(jìn)行定量測定，蛋白加熱變性，配制10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），取等量蛋白上樣，行電泳分離蛋白，隨后電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，在封閉液中孵育2 h，洗滌后加入稀釋的相應(yīng)一抗，Wnt1、β-catenin 和Survivin 一抗均為1 ∶800 稀釋，4 ℃雜交過夜，洗滌后再加入1 ∶3 000稀釋的二抗，室溫孵育2 h，洗滌后采用電化學(xué)發(fā)光（ECL）顯影，隨后獲取圖像，以β-actin 進(jìn)行標(biāo)定，分別計算各組MHCC97-H 細(xì)胞中目的蛋白相對表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 PLB 對MHCC97-H 細(xì)胞增殖抑制作用 不同濃度的PLB 對MHCC97-H 細(xì)胞增殖有不同程度的抑制作用，且呈濃度依賴性（均P＜0.05）。見表1。與24 h 和72 h 相比，PLB 在干預(yù)48 h 時對MHCC97-H 細(xì)胞增殖抑制作用的隨濃度的升高而快速增強，且未出現(xiàn)平臺期，后續(xù)選取干預(yù)48 h 作為實驗干預(yù)時間。計算獲得PLB 干預(yù)MHCC97-H 細(xì)胞48 h 的IC50 為8.25 μmol/L，選取約1/2 IC50 濃度4 μmol/L 作為后續(xù)實驗干預(yù)濃度。

表1 PLB 對MHCC97-H 細(xì)胞增殖抑制率的影響(,n=9,%)

表1 PLB 對MHCC97-H 細(xì)胞增殖抑制率的影響(,n=9,%)

與PLB 0 μmol/L 組比:1）P＜0.05；與同一時刻前一組比較:2）P＜0.05

2.2 PLB 對MHCC97-H 細(xì)胞克隆形成能力的影響 與Blank 組比較，PLB 組MHCC97-H 細(xì)胞克隆形成率明顯降低（P＜0.05），而LiCl 組克隆形成率升高（P＜0.05）；與PLB 組比較，PLB+LiCl 組MHCC97-H細(xì)胞克隆形成率明顯升高（P＜0.05）。見表2。

表2 各組MHCC97-H 細(xì)胞克隆形成率、相對遷移率、穿膜MHCC97-H 細(xì)胞數(shù)、MMP-2 及MMP-9 水平比較(,n=9)

表2 各組MHCC97-H 細(xì)胞克隆形成率、相對遷移率、穿膜MHCC97-H 細(xì)胞數(shù)、MMP-2 及MMP-9 水平比較(,n=9)

與Blank 組比較:1）P＜0.05；與PLB 組比較:2）P＜0.05

2.3 PLB 對MHCC97-H 細(xì)胞遷移能力的影響 與Blank 組比較，PLB 組MHCC97-H 細(xì)胞相對遷移率明顯降低（P＜0.05），而LiCl 組MHCC97-H 細(xì)胞相對遷移率升高（P＜0.05）；與PLB 組比較，PLB+LiCl組MHCC97-H 細(xì)胞相對遷移率明顯升高（P＜0.05）。見表2。

2.4 PLB 對MHCC97-H 細(xì)胞侵襲能力的影響 與Blank 組比較，PLB 組穿膜MHCC97-H 細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.05），而LiCl 組穿膜MHCC97-H 細(xì)胞數(shù)增多（P＜0.05）；與PLB 組比較，PLB+LiCl 組穿膜MHCC97-H 細(xì)胞數(shù)明顯增多（P＜0.05）。見表2。

2.5 PLB 對MHCC97-H 細(xì)胞上清中MMP-2 和MMP-9 水平的影響 與Blank 組比較，PLB 組MHCC97-H 細(xì)胞上清液中MMP-2 和MMP-9 水平明顯降低（P＜0.05），而LiCl 組中MMP-2 和MMP-9 水平升高（P＜0.05）；與PLB 組比較，PLB+LiCl 組中MMP-2 和MMP-9 明顯升高（P＜0.05）。見表2。

2.6 PLB 對MHCC97-H 細(xì)胞中Wnt 信號活化的影響 與Blank 組比較，PLB 組MHCC97-H 細(xì)胞中Wnt1、β-catenin 和Survivin 蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)（P＜0.05），而LiCl 組中Wnt1、β-catenin 和Survivin蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)（P＜0.05）；與PLB 組比較，PLB+LiCl 組中Wnt1、β-catenin 和Survivin 蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)（P＜0.05）。見圖1、表3。

圖1 Western 印跡檢測MHCC97-H 細(xì)胞中Wnt1、β-catenin 和Survivin 蛋白的表達(dá)

表3 各組MHCC97-H 細(xì)胞中Wnt1、β-catenin 和Survivin 蛋白表達(dá)水平比較(,n=9)

表3 各組MHCC97-H 細(xì)胞中Wnt1、β-catenin 和Survivin 蛋白表達(dá)水平比較(,n=9)

與Blank 組比較:1）P＜0.05；與PLB 組比較:2）P＜0.05

3 討論

肝癌是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一〔9〕。目前肝癌的治療策略包括手術(shù)、化療和放療，由于化療藥物和電離輻射存在非特異性細(xì)胞毒性，在殺傷癌細(xì)胞的同時對正常細(xì)胞也產(chǎn)生毒害作用，因此導(dǎo)致其對患者的毒副作用較大；加之患者產(chǎn)生耐藥性和化療耐受性大大影響了肝癌的治療效果〔10〕。中藥用于臨床治療各種癌癥包括肝癌，可延緩并發(fā)癥的發(fā)生，提高患者的生活質(zhì)量〔11〕。多項研究表明，PLB 對黑色素瘤、胃癌和食管癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞有明顯的抑制作用〔12，13〕。研究顯示，PLB 處理通過抑制PI3K/Akt 途徑降低人舌鱗狀細(xì)胞癌CAL27細(xì)胞活力和集落形成，并增加細(xì)胞凋亡〔14〕。研究顯示，PLB 通過減少STAT3 的磷酸化抑制食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的生長〔15〕。Kang 等〔16〕研究發(fā)現(xiàn)，PLB 通過抑制由FAK/AKT 途徑介導(dǎo)的Rho 相關(guān)激酶途徑降低了骨橋蛋白誘導(dǎo)的非小細(xì)胞肺癌A549 細(xì)胞的侵襲，抑制骨橋蛋白誘導(dǎo)的Balb/c 小鼠肺轉(zhuǎn)移。朱德強等〔17〕研究發(fā)現(xiàn)，PLB 能抑制索拉菲尼耐藥細(xì)胞HepG2R 增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，通過提高HepG2R 細(xì)胞中活性氧（ROS）含量來改善對索拉菲尼的耐藥性。然而，PLB 對肝癌MHCC97-H 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及分子機制尚不清楚。

本研究提示PLB 在肝癌中發(fā)揮抗腫瘤的作用，這與以往研究〔18〕相符。MMP-2 和MMP-9 均通過降解細(xì)胞外基質(zhì)成分賦予細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力，在腫瘤侵襲和遷移中發(fā)揮重要作用〔19〕。本研究結(jié)果提示PLB可通過調(diào)控MMP-2 和MMP-9 的表達(dá)抑制MHCC97-H 細(xì)胞遷移和侵襲。Wnt 信號通路在正常胚胎發(fā)育和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用，此外，它還調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、遷移和分化等多種生物學(xué)行為〔20〕。研究表明，Wnt 信號通路在多種類型的癌癥中激活失調(diào)，因此，阻斷Wnt 信號傳導(dǎo)途徑是癌癥治療的策略〔21，22〕。β-catenin 在Wnt 信號傳導(dǎo)途徑中起關(guān)鍵作用，細(xì)胞質(zhì)中β-catenin 通常通過蛋白酶體降解維持在較低水平。Wnt1 蛋白與卷曲蛋白受體的結(jié)合導(dǎo)致未磷酸化的β-catenin 積累，其轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中并激活Wnt 靶基因的表達(dá)，包括Survivin〔23，24〕。Survivin 是主要抗癌靶標(biāo)之一，其屬于凋亡抑制因子，參與細(xì)胞分裂和凋亡抑制，可與β-catenin 相互作用調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖〔25〕。本研究結(jié)果提示PLB 能抑制Wnt 信號通路的激活。此外，本研究結(jié)果表明PLB 可通過調(diào)控Wnt 信號通路抑制MHCC97-H 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

綜上，PLB 可抑制肝癌MHCC97-H 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，其作用機制可能與阻斷Wnt 信號通路的激活有關(guān)。然而，在Wnt 信號通路中存在多個上游及下游靶基因，并且在肝癌靶向中存在復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，因此有待后續(xù)實驗深入探究。